Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Summary

Canlı hücrelerin plazma zarında ligand bağlanması ile indüklenen mEGFP etiketli-reseptör oligomerlerinin ortalama oligomerik durumunun belirlenmesi için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır.

Abstract

Reseptör oligomerizasyonunun önemi ne kadar önemli ve her yerde yer alsa da, kümeleme olaylarının saptandırılması ve kümelenme derecesinin ölçülmesi için çok az yöntem uygulanmaktadır. Burada, canlı hücrelerin zarındaki mEGFP etiketli-reseptör homokomplekslerinin ortalama oligomerik durumunu belirlemek için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır. N&B, floresan-korelasyon spektroskopisi (FCS) ve foton sayma histogramına (PCH) benzer bir yöntemdir ve floresan ların floresan şiddetindeki dalgalanmaların bir aydınlatmaya girip çıkmasındaki dalgalanmaların istatistiksel analizine dayanır. bir gözlem süresi boyunca hacim. Özellikle, N & B oligomerik karışımların proteinlerin ortalama sayısı hakkında bilgi edinmek için PCH bir basitleştirme olduğunu. Yoğunluk dalgalanma genlikleri floroformoleküler parlaklık ve aydınlatma hacmi içinde floroforların ortalama sayısı ile tanımlanır. Böylece, N & B genlik dağılımı, yani, ortalama yoğunluğu ve varyans sadece ilk ve ikinci anları dikkate alır. Bu, aynı zamanda, güç ve yöntemin zayıflığıdır. Sadece iki dakika düşünüldüğünden, N&B bir karışımdaki bilinmeyen oligomerlerin molar fraksiyonunu belirleyemez, ancak sadece karışımın ortalama oliomerizasyon durumunu tahmin eder. Bununla birlikte, sadece floresan yoğunluğunun zaman dalgalanmalarını izleyerek, canlı hücrelerin görüntülerinin piksel piksel bazında nispeten küçük zaman serilerine (diğer an yöntemleriyle karşılaştırıldığında) uygulanabilir. Piksel başına etkili süreyi birkaç mikrosaniyeye düşürerek saniyeler ile milisaniye arasında zaman aralığında edinme sağlar ve bu da hızlı oligomerizasyon kinetikleri için gereklidir. Son olarak, büyük hücre alanları ve alt hücre altbölümleri incelenebilir.

Introduction

Canlı hücrelerin plazma zarındaki reseptör moleküllerinin ortalama oligomerik durumunu belirlemek için toplam Internal Yansıma Floresan-Sayı ve Parlaklık (TIRF-Sayı ve Parlaklık) görüntüleme yaklaşımını, reseptör diziliyi bağlamayı amaçlayan bir toplam iç yansıma floresan-sayı ve parlaklık (TIRF-N&B) görüntüleme yaklaşımını tanımladık. proteinlerin biyolojik işlevine dinamikler (Şekil 1).

Hücre dışı ligand bağlanması üzerine reseptörler konformasyonlarına, oliomerizasyonlarına, potansiyel ko-reseptörlerine ve membran kompozisyonlarına bağlı olarak hücre içi sinyal iletimini başlatırlar. Reseptör oligomerizasyonunun önemi ve....

Protocol

1. Örnek Hazırlama

1. Birinci gün. Cam dipli yemeklerde 100.000-200.000 hücre/mL konsantrasyonda tam ortamda Tohum HeLa hücreleri. Tohum 6-8 çoğaltmak yemekleri.
   NOT: Bu örnekte ortam %10 ısı inaktive Fetal Sığır Serumu (FBS), 1 mM sodyum pirüuvat, 100 U/100 μg penisilin/streptomisin ile desteklenmektedir. Birkaç çoğaltma yemekleri hazırlanır.
2. 2-3. gün. Hücreler alt-fluency olduğunda, protein plazmid ile yemeklerin yarısını transfect ve referans plazmidler il.......

Discussion

N & B hücre modeli ve etiketleme stratejisi seçiminde çeşitli önlemler gerektirir. Yalnızca görüntü yakalama süresi boyunca uygun şekilde yapışmış kalan canlı hücrelere uygulanabilir. Tüm hücre katı deplasman nedeniyle ekstra dalgalanmalar uygun görüntü restorasyon yaklaşımları ile ele alınabilir³⁸. Ancak, genellikle bir hücre hareket ettiğinde, hücre zarı da deforme olur, ve yapı deformasyonu, büyük ekstra varyans üreten, membran proteinlerinin analizi için cid.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections