Espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR

Le proteine SNX-BAR sono una classe evolutivamente conservata di proteine di rimodellamento della membrana che svolgono un ruolo chiave nella selezione e nel traffico di proteine e lipidi durante l'endocitosi, lo smistamento all'interno del sistema endosomico e l'autofagia. Fondamentale per la funzione della proteina SNX-BAR è la capacità di formare omodimeri o eterodimeri che legano le membrane utilizzando domini di fox-homologia (PX) e BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Inoltre, l'oligomerizzazione dei dimeri SNX-BAR sulle membrane può suscitare la formazione di tubuli e vesciche di membrana e questa attività è pensata per riflettere le loro funzioni come proteine del mantello per i portatori di trasporto derivati dall'endosoma. I ricercatori hanno a lungo utilizzato studi di legame in vitro utilizzando proteine SNX-BAR ricombinanti su liposomi sintetici o vescicle unilamellar giganti (GUT) per rivelare la marcatura precisa dei lipidi necessari per guidare il rimodellamento della membrana, rivelando così il loro meccanismo di azione. Tuttavia, a causa di sfide tecniche con sistemi a doppia espressione, tossicità dell'espressione proteica SNX-BAR nei batteri e scarsa solubilità delle singole proteine SNX-BAR, la maggior parte degli studi finora hanno esaminato gli omodimeri SNX-BAR, compresi i dimeri non fisiologici che si formano durante l'espressione nei batteri. Recentemente, abbiamo ottimizzato un protocollo per superare le principali carenze di un tipico sistema di espressione batterica. Utilizzando questo flusso di lavoro, dimostriamo come esprimere e purificare con successo grandi quantità di eterodimeri SNX-BAR e come ricostituirli su liposomi sintetici per i saggi di rilegatura e tubazione.