Label-fri Immunoprecipitation massespektrometri workflow for storstilet nuklear Interactome profilering

Immun affinitet rensning massespektrometri (IP-MS) er dukket op som en robust kvantitativ metode til at identificere protein-protein interaktioner. Denne publikation præsenterer en komplet interaktion proteomics workflow designet til at identificere lav overflod protein-protein interaktioner fra kernen, der også kunne anvendes til andre subcellulære rum. Denne arbejdsgang omfatter subcellulære fraktionering, immunoprecipitation, prøveforberedelse, offline oprydning, enkelt skudt label-fri massespektrometri, og downstream beregningsmæssige analyse og datavisualisering. Vores protokol er optimeret til påvisning af opdelte, lave overflod interaktioner, der er svære at identificere fra hele celle lysater (f. eks. transkriptionsfaktor interaktioner i kernen) ved immunopræcipitation af endogene proteiner fra fraktionerede subcellulære rum. Prøve forberedelses rørledningen skitseret her giver detaljerede instruktioner til fremstilling af HeLa celle nukleare ekstrakt, immun affinitet rensning af endogene agn protein, og kvantitativ massespektrometri analyse. Vi diskuterer også metodologiske overvejelser for at udføre storstilet immunopræcipitation i massespektrometri-baserede interaktions profilerings eksperimenter og giver retningslinjer for evaluering af datakvaliteten for at skelne ægte positivt protein interaktioner fra ikke-specifikke interaktioner. Denne fremgangsmåde er påvist her ved at undersøge den nukleare interactome af CMGC kinase, DYRK1A, en lav forekomst protein kinase med dårligt definerede interaktioner i kernen.