대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

면역친화 질량 분석법(IP-MS)은 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 강력한 정량적 방법으로 부상하였다. 이 간행물은 또한 그밖 세포외 구획에 적용될 수 있는 핵에서 낮은 풍부한 단백질 단백질 상호 작용을 확인하기 위하여 디자인된 완전한 상호 작용 proteomics 워크플로우를 제출합니다. 이 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 샘플 준비, 오프라인 정리, 단일 샷 라벨 없는 질량 분석법, 다운스트림 계산 분석 및 데이터 시각화가 포함됩니다. 우리의 프로토콜은 전체 세포 용해물 (예를 들어, 핵에서 전사 인자 상호 작용)에서 내인성 단백질의 면역 침전에 의해 식별하기 어려운 구획화, 낮은 풍부 상호 작용을 검출하기 위해 최적화되어 있습니다. 분별 된 세포 실. 여기에 설명된 샘플 제제 파이프라인은 HeLa 세포 핵 추출물의 제조, 내인성 미끼 단백질의 면역 친화성 정제 및 정량 질량 분석 분석에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 또한 질량 분석 기반 상호 작용 프로파일링 실험에서 대규모 면역 침전을 수행하기 위한 방법론적 고려 사항에 대해 논의하고 진정한 양성 단백질을 구별하기 위한 데이터 품질 평가 지침을 제공합니다. 비특이적 상호 작용에서 상호 작용. 이 접근법은 CMGC 키나아제, DYRK1A, 핵 내의 잘못 정의된 상호작용을 갖는 낮은 풍부 단백질 키나아제의 핵 상호작용을 조사함으로써 여기에서 입증된다.