Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Isl^mn:GFP Ratos Transgênicos

Neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) apresentam notável resistência a doenças degenerativas do neurônio motor, como esclerose lateral amiotrófica (ELA) quando comparados aos neurônios motores espinhais (SMNs). A capacidade de isolar e cultura cn3s rato primário, CN4s, e SMNs proporcionaria uma abordagem para estudar os mecanismos subjacentes a esta vulnerabilidade seletiva. Até o momento, a maioria dos protocolos utiliza culturas géterogêneas celulares, que podem confundir a interpretação dos resultados experimentais. Para minimizar os problemas associados às populações de células mistas, as culturas puras são indispensáveis. Aqui, o primeiro protocolo descreve em detalhes como purificar e cultivar eficientemente CN3s/CN4s ao lado de contrapartes de SMNs dos mesmos embriões usando o dia embrionário 11.5 (E11.5) Isl^MN:GFP embriões transgênicos do rato. O protocolo fornece detalhes sobre a dissecção e dissociação de tecidos, isolamento celular baseado em FACS e cultivo in vitro de células dos núcleos CN3/CN4 e SMN. Este protocolo adiciona um novo sistema de cultura CN3/CN4 in vitro aos protocolos existentes e, simultaneamente, fornece uma cultura SMN pura e de espécies combinadas para comparação. Análises com foco nas características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores são viáveis neste sistema de cultura. Este protocolo permitirá a pesquisa nos mecanismos que definem o desenvolvimento do neurônio motor, a vulnerabilidade seletiva, e a doença.