Fusão célula-célula de linhas celulares editados do genoma para perturbação da estrutura celular e função

Resumo

O objetivo deste protocolo é fundir dois tipos de células diferentes para criar células híbridas. A análise da microscopia da fluorescência de pilhas fundidas é usada para seguir a pilha da origem de organelas celulares. Este ensaio pode ser usado para explorar como a estrutura celular e função responder à perturbação por fusão celular.

Resumo

A vida é espacialmente divisória dentro das membranas lipídicas para permitir a formação isolada de estados moleculares distintos dentro de células e organelas. A fusão celular é a fusão de duas ou mais células para formar uma única célula. Aqui nós fornecemos um protocolo para a fusão celular de dois tipos de células diferentes. As células híbridas fundidas são enriquecidas pela classificação baseada em citometria de fluxo, seguida supérpia de fluorescência da estrutura e função das células híbridas. As proteínas fluorescentemente marcadas geradas pela edição do genoma são imagemdas dentro de células fundidas, permitindo que estruturas celulares sejam identificadas com base na emissão de fluorescência e referenciadas de volta ao tipo de origem celular. Este método robusto e geral pode ser aplicado a diferentes tipos de células ou organelas de interesse, para compreender a estrutura celular e função em uma série de questões biológicas fundamentais.

Introdução

A manutenção homeostática da estrutura celular é fundamental para a vida. As células têm morfologias características, números de organelasubcelulares e composição bioquímica interna. Compreender como essas propriedades fundamentais são geradas e como elas dão errado durante a doença requer ferramentas de laboratório para perturbá-las.

A fusão celular é a fusão de duas ou mais células separadas. A fusão celular pode ter sido fundamental para o surgimento da vida eucariótica^1. No corpo humano, a fusão celular é relativamente rara, ocorrendo durante circunstâncias de desenvolvimento restritas e tipos de tecido, como dur....

Protocolo

1. Rotulagem de células fluorescentes diferenciais

1. Marcação de genes com CRISPR Cas9
   1. Use crispr cas9 genoma edição para tag rootletin (ou outros genes de interesse) com as proteínas fluorescentes meGFP ou mScarlet-I em linhas de células cancerosas humanas.
      Nota: Protocolos detalhados para edição do genoma são cobertos em outros lugares^24,25,26.
2. Rotulagem de corante fluorescente
   1. Crescer cal51 células cancerosas humanas no meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) complementada com 10% de soro bovino fetal (....

Resultados

Células devidamente rotuladas são visíveis durante a citometria de fluxo por sinal de fluorescência maior do que as células de controle não rotuladas (Figura 2A). As portas são ajustadas para a classificação de pilhas positivas dobro, enriquecendo esta população diretamente em pratos da imagem latente para umas análises microscópicas mais adicionais. As células fundidas são detectáveis como células distintas duplamente positi.......

Discussão

Demonstramos um protocolo fácil e econômico para a fusão de células e a visualização da arquitetura subsequente de híbridos celulares com microscopia, levando aproximadamente dois dias do início ao fim. Partes críticas deste protocolo são o enriquecimento de células fundidas por classificação celular (seção 3 protocolar), e validação cuidadosa de células fundidas por microscopia (seção de protocolo 4). Estas seções garantem que as células fundidas são facilmente obtidas e são heterokaryons de boa.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml tube	Sarstedt	62554502
37% formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope	Carl Zeiss
8-well imaging dishes	Ibidi	80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody	Chromotek	gba-488
BD Influx Cell Sorter	BD Biosciences
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cell Filters (70um)	Biofil	CSS010070
CellTrace Far Red	ThermoFisher Scientific	C34572
CellTrace Violet	ThermoFisher Scientific	C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966021
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody	NanoTag Biotechnologies	N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium	Sigma-Aldrich	21083027
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	15140122
Phenol red free DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS)			8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450	Sigma-Aldrich	P7181
Polypropylene tubes	BD Falcon	352063
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151	nonionic surfactant
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337	nonionic detergent