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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

O objetivo deste protocolo é fundir dois tipos de células diferentes para criar células híbridas. A análise da microscopia da fluorescência de pilhas fundidas é usada para seguir a pilha da origem de organelas celulares. Este ensaio pode ser usado para explorar como a estrutura celular e função responder à perturbação por fusão celular.

Abstract

A vida é espacialmente divisória dentro das membranas lipídicas para permitir a formação isolada de estados moleculares distintos dentro de células e organelas. A fusão celular é a fusão de duas ou mais células para formar uma única célula. Aqui nós fornecemos um protocolo para a fusão celular de dois tipos de células diferentes. As células híbridas fundidas são enriquecidas pela classificação baseada em citometria de fluxo, seguida supérpia de fluorescência da estrutura e função das células híbridas. As proteínas fluorescentemente marcadas geradas pela edição do genoma são imagemdas dentro de células fundidas, permitindo que estruturas celulares sejam identificadas com base na emissão de fluorescência e referenciadas de volta ao tipo de origem celular. Este método robusto e geral pode ser aplicado a diferentes tipos de células ou organelas de interesse, para compreender a estrutura celular e função em uma série de questões biológicas fundamentais.

Introduction

A manutenção homeostática da estrutura celular é fundamental para a vida. As células têm morfologias características, números de organelasubcelulares e composição bioquímica interna. Compreender como essas propriedades fundamentais são geradas e como elas dão errado durante a doença requer ferramentas de laboratório para perturbá-las.

A fusão celular é a fusão de duas ou mais células separadas. A fusão celular pode ter sido fundamental para o surgimento da vida eucariótica1. No corpo humano, a fusão celular é relativamente rara, ocorrendo durante circunstâncias de desenvolvimento restritas e tipos de tecido, como dur....

Protocol

1. Rotulagem de células fluorescentes diferenciais

  1. Marcação de genes com CRISPR Cas9
    1. Use crispr cas9 genoma edição para tag rootletin (ou outros genes de interesse) com as proteínas fluorescentes meGFP ou mScarlet-I em linhas de células cancerosas humanas.
      Nota: Protocolos detalhados para edição do genoma são cobertos em outros lugares24,25,26.
  2. Rotulagem de c.......

Representative Results

Células devidamente rotuladas são visíveis durante a citometria de fluxo por sinal de fluorescência maior do que as células de controle não rotuladas (Figura 2A). As portas são ajustadas para a classificação de pilhas positivas dobro, enriquecendo esta população diretamente em pratos da imagem latente para umas análises microscópicas mais adicionais. As células fundidas são detectáveis como células distintas duplamente positi.......

Discussion

Demonstramos um protocolo fácil e econômico para a fusão de células e a visualização da arquitetura subsequente de híbridos celulares com microscopia, levando aproximadamente dois dias do início ao fim. Partes críticas deste protocolo são o enriquecimento de células fundidas por classificação celular (seção 3 protocolar), e validação cuidadosa de células fundidas por microscopia (seção de protocolo 4). Estas seções garantem que as células fundidas são facilmente obtidas e são heterokaryons de boa.......

Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por um Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship para R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant número 100090/12/Z). O financiador não teve nenhum papel no projeto do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos a Ashok Venkitaraman e Paul French por conselhos críticos e orientações sobre o projeto. Agradecemos a Chiara Cossetti e Gabriela Grondys-Kotarba no Instituto de Pesquisa Médica de Cambridge Flow Citometria facilidade para um excelente apoio. Agradecemos a Liam Cassiday, Thomas Miller e Gianmarco Contino pela revisão do manuscrito.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml tubeSarstedt62554502
37% formaldehyde solutionSigma-AldrichF8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan MicroscopeCarl Zeiss
8-well imaging dishesIbidi80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobodyChromotekgba-488
BD Influx Cell SorterBD Biosciences
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906
Cell Filters (70um)BiofilCSS010070
CellTrace Far RedThermoFisher ScientificC34572
CellTrace VioletThermoFisher ScientificC34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvateThermoFisher Scientific31966021
Fetal Bovine SerumSigma-Aldrich10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobodyNanoTag BiotechnologiesN1302-At565
L15 CO2 independent imaging mediumSigma-Aldrich21083027
Penicillin/streptomycinSigma-Aldrich15140122
Phenol red free DMEM, high glucoseThermoFisher Scientific21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS)8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450Sigma-AldrichP7181
Polypropylene tubesBD Falcon352063
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151nonionic surfactant
TrypsinSigma-AldrichT4049
Tween 20Fisher BioReagentsBP337nonionic detergent

References

  1. Lane, N. . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).
  2. Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
  3. Köhler, G., Milstein, C.

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