Agradecemos a Y. A. Pan, J. Livet y Z. Tobias por sus contribuciones técnicas e intelectuales. Este trabajo fue apoyado por la National Science Foundation (Premio 1553764) y el M.J. Murdock Charitable Trust.

Los procedimientos relacionados con sujetos de animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Lewis & Clark College.
1. Microinyección de embriones de pez cebra
<ol><li>Establecer el tipo salvaje, pez cebra adulto en tanques de apareamiento segregados por sexo la tarde antes de realizar microinyecciones39,40.</li>
	<li>Prepare la solución de ADN en la mañana de las microinyecciones...

Este protocolo describe un método para visualizar clones de células progenitoras y neuronas en el cerebro trasero de pez cebra en desarrollo y seguirlos in vivo utilizando Brainbow y la microscopía confocal de lapso de tiempo11. La principal ventaja de este protocolo en comparación con los estudios in vitro o ex vivo es la capacidad de observar directamente la zona proliferativa del cerebro vertebrado en su entorno natural a lo largo del tiempo. Esta técnica se basa en estudios anteriores que...

En las primeras fases del desarrollo, las piscinas de células progenitoras especializadas se dividen repetidamente en zonas proliferativas, produciendo diversos arreglos de células hijas. Las células nacidas durante este período de desarrollo se diferenciarán y viajarán para formar los órganos nacientes. En el sistema nervioso, los progenitores como la glia radial dan lugar a neuronas inmaduras en zonas ventriculares. A medida que las neuronas se alejan de los ventrículos y maduran, el tejido en expansión eventualmente forma las estructuras altamente complejas del cerebro1,2,3,4,5,6. La coordinación entre la división de los progenitores y la diferenciación y migración de las neuronas determinará el tamaño, la forma y, por tanto, la función del cerebro, afectando directamente al comportamiento7,8,9,10. Si bien el control estricto sobre estos procesos es claramente crucial para el desarrollo normal del cerebro, los mecanismos globales que regulan estas dinámicas no se entienden bien. Aquí describimos una herramienta para estudiar el desarrollo del sistema nervioso a una resolución celular, permitiendo a los investigadores visualizar las células progenitoras y las neuronas in vivo en el cerebro de pez cebra en desarrollo con Brainbow y realizar un seguimiento de su comportamiento a lo largo del tiempo a través de la microscopía confocal de lapso de tiempo11. El enfoque también se puede adaptar para visualizar otras partes del embrión en desarrollo.
Para observar y distinguir entre las células en el cerebro de pez cebra en desarrollo, hemos adaptado la técnica de etiquetado celular Brainbow11. Brainbow utiliza la expresión combinatoria determinada aleatoriamente de tres proteínas fluorescentes distintas (FP) para etiquetar una población de células. Mientras que la expresión predeterminada para la expresión de Brainbow es el FP rojo dTomato, la recombinación por la enzima Cre recombinase da como resultado la expresión de mCerulean (proteína fluorescente cian, CFP) o proteína fluorescente amarilla (YFP)12,13. La cantidad combinada de cada FP expresada en una celda le da un matiz único, lo que permite una clara distinción visual de las celdas vecinas. Además, cuando una célula progenitora se divide, cada célula hija heredará el color de su célula madre, produciendo clones codificados por colores y permitiendo a los investigadores rastrear el linaje celular11,14. Aunque originalmente se utiliza bañó para analizar circuitos neuronales en ratones12,Brainbow se ha expresado desde entonces en una amplia variedad de organismos modelo, incluyendo el pez cebra15.
Nuestra técnica se basa en métodos anteriores de etiquetado y imagen multicolor para crear imágenes directamente de varios clones codificados por colores a lo largo del tiempo en peces cebra vivos. Debido a su transparencia óptica como embriones, los peces cebra son muy adecuados para los experimentos de imagen16,y estudios anteriores han utilizado Brainbow en el pez cebra para estudiar una variedad de tejidos, incluyendo el sistema nervioso11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. La capacidad de imagen directa en el organismo vivo, junto con su rápido desarrollo ex utero, hacen del pez cebra un modelo valioso de desarrollo de vertebrados. A diferencia del cerebro de los mamíferos, toda la zona proliferativa del cerebro trasero del pez cebra está fácilmente disponible para la toma de imágenes sin interrupción de su entorno endógeno6. Esto permite que los experimentos se lleven a cabo en el organismo vivo, en lugar de en preparaciones de tejido sin vitro o fijos. A diferencia de los experimentos de imágenes fijas, los estudios in vivo permiten un diseño longitudinal, produciendo horas de datos que se pueden analizar en busca de patrones, aumentando así la probabilidad de observar eventos relativamente raros. Dependiendo de la velocidad y la duración de los eventos de interés, los investigadores pueden optar por realizar experimentos cortos (1-2 h) o largos (hasta 16 h) de imágenes de lapso de tiempo. Mediante el uso del promotor de choque térmico de pez cebra 70 (hsp70, hsp), la expresión de Brainbow se puede controlar temporalmente28,29. Además, la expresión de mosaico inducida por este promotor es muy adecuada para etiquetar y rastrear muchos clones11.
La capacidad de identificar visualmente múltiples clones dentro del cerebro vivo es una ventaja de este método. Importantes estudios previos que investigaron el papel de los clones dentro del desarrollo del sistema nervioso utilizaron vectores retrovirales para etiquetar una sola célula progenitora y su progenie usando una sola FP u otra proteína fácilmente visualizada. Dicho etiquetado permite a los investigadores observar un solo clon a lo largo del tiempo, ya sea in vitro o in vivo2,,30,31,32,33,34,35,36,37,38. A diferencia de los métodos para rastrear el comportamiento de las células dentro de un clon, los distintos colores de Brainbow permiten a los investigadores observar la dinámica entre los clones. Además, al usar Brainbow para etiquetar muchos clones dentro del cerebro, se recopilan datos adicionales sobre el comportamiento clonal en relación con las técnicas que etiquetan un solo clon11. Es importante destacar que los enfoques descritos aquí se pueden ampliar para generar comparaciones de desarrollo entre peces que han sufrido diferentes manipulaciones genéticas o farmacológicas18. En general, estas ventajas hacen que las imágenes confocales in vivo de barcoiris expresen el tamaño de los peces cebra sean ideales para investigadores que exploran el desarrollo del sistema nervioso de los vertebrados, en particular aquellos interesados en el papel de los clones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

El desarrollo del sistema nervioso vertebrado requiere una coordinación precisa de comportamientos e interacciones celulares complejos. El uso de técnicas de imagen in vivo de alta resolución puede proporcionar una ventana clara a estos procesos en el organismo vivo. Por ejemplo, las células divisorias y su progenie se pueden seguir en tiempo real a medida que se forma el sistema nervioso. En los últimos años, los avances técnicos en técnicas multicolor han ampliado los tipos de preguntas que se pueden investigar. El enfoque brainbow multicolor se puede utilizar no sólo para distinguir entre celdas similares, sino también para codificar por colores varios clones diferentes de celdas relacionadas que cada uno deriva de una celda progenitora. Esto permite un análisis de linaje multiplex de muchos clones diferentes y sus comportamientos simultáneamente durante el desarrollo. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor es en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo. Esto es particularmente útil para seguir las interacciones celulares entre células similares, que son difíciles de etiquetar diferencialmente utilizando colores tradicionales impulsados por el promotor. Nuestro enfoque se puede utilizar para rastrear las relaciones de linaje entre varios clones diferentes simultáneamente. Los grandes conjuntos de datos generados con esta técnica proporcionan información rica que se puede comparar cuantitativamente a través de manipulaciones genéticas o farmacológicas. En última instancia, los resultados generados pueden ayudar a responder preguntas sistemáticas sobre cómo se desarrolla el sistema nervioso.

En esta sección se ilustran ejemplos de resultados que se pueden obtener utilizando el enfoque de imágenes de lapso de tiempo multicolor in vivo que se describe aquí. Mostramos que Brainbow clona de células codificadas por colores en la zona ventricular proliferativa del cerebro trasero de pez cebra en desarrollo14 (Figura 1).
Normalmente, cuando las celdas etiquetadas con Brainbow se organizaban a lo largo de una fibra radial determina...

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Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

La imagen in vivo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para investigar los mecanismos celulares subyacentes al desarrollo del sistema nervioso. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales sobre la dinámica de las células progenitoras neuronales y su progenie que subyacen al desarrollo cerebral de los vertebrados. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de visualizar directamente múltiples grupos de células relacionadas clonalmente dentro del cerebro vivo durante muchas horas de desarrollo. El protocolo también se puede aplicar al estudio de la dinámica clonal y progenitora en otros sistemas en desarrollo del embrión de pez cebra.La visualización mediante este método es especialmente útil para observar directamente los procesos fundamentales que se producen durante el desarrollo neuronal. En la tarde anterior a la realización de microinyeccións, establecer peces cebra adultos de tipo salvaje en tanques de apareamiento segregados por sexo. A la mañana siguiente prepare la solución de ADN de acuerdo con las instrucciones del manuscrito e inyecte aproximadamente 4,2 nano litros de esta solución en embriones de pez cebra de una célula dentro de los 45 minutos posteriores a la fertilización.Mantener los embriones inyectados en E tres medianas y una incubadora de 28 grados Celsius durante 24 horas, luego llamar a los embriones muertos y deformados del grupo. Transfiera hasta 20 embriones sanos a un tubo de 50 mililitros, llénelo con 10 mililitros de E tres y coloque una tapa encima de cada tubo. Coloque un estante con los tubos de 50 mililitros en posición vertical en un baño de agua de 37 grados Centígrados durante 80 a 90 minutos, asegurándose de que el nivel de agua en el baño sea superior al E tres en el tubo.Retire el portatubos del baño de agua y colóquelo en la incubadora de 28 grados Centígrados. Espere hasta una hora para que el E tres se enfríe y los embriones se vuelvan a reacclimar a la temperatura. Luego transfiéralos a los platos de Petri con 0,2 PTU milimétricas y E tres mantenidos calientes en la incubadora de 28 grados Centígrados.A las dos o cuatro horas después del choque térmico, examine los embriones bajo un microscopio estándar de disección de fluorescencia para la expresión de CFP o YFP que indica una recombinación exitosa de Brainbow. Seleccione embriones con una expresión de FP robusta y transfiérelos a un plato separado con PTU. Iimagen de uno, dos o tres días después de la fertilización.La expresión que aparece tenue bajo un microscopio de fluorescencia puede visualizarse bien en imágenes de lapso de tiempo confocal. Antes del día del experimento, prepare la cámara de imágenes y la herramienta de manipulación de embriones. Para preparar la cámara de imágenes, supere cuidadosamente un anillo de plástico al centro de una placa Petri de 60 milímetros.Construir el manipulador mediante el pegado súper de una pequeña longitud de línea de pesca de nylon hasta el final de un palo de hisopo de madera de cuatro pulgadas. Si es necesario, descorte los embriones bajo un microscopio de disección antes del montaje. Para montar los embriones, transfiera el pez al centro del anillo de plástico en la cámara de imágenes y retire tanto el exceso de E tres como sea posible con una pipeta de transferencia de punta fina.Utilice una pipeta de transferencia limpia para cubrir el pescado con un uno por ciento de agarosa de bajo derretimiento y E tres, llenando todo el anillo de plástico con una capa de agarosa. A continuación, tire suavemente del embrión hacia arriba en la punta de la pipeta y de nuevo en la agarosa sin introducir ninguna burbuja de aire. Utilice un manipulador embrionario para orientar rápidamente el pescado y la agarosa antes de que se endurezca.Si realiza una toma de imágenes con un microscopio vertical, coloque el embrión lo más cerca posible de la superficie superior de la agarosa, asegurándose de que sean paralelos a la parte inferior de la cámara de imágenes con la cola recta. Espere a que la agarosa se endurezca, luego llene la cámara de imágenes con E tres, añadiendo tanto como sea posible para explicar la evaporación en el transcurso de la toma de imágenes. Coloque la cámara de imágenes con el pez y E tres en el microscopio confocal.A continuación, seleccione el objetivo con una apertura numérica alta y una larga distancia de trabajo. Encuentre una región con un etiquetado de celdas adecuadamente denso y brillante y configure los parámetros de adquisición. Este es un ejemplo con el software Zen, pero los ajustes variarán dependiendo del microscopio y las líneas láser disponibles.Prepare tres pistas para poner una imagen secuencial de cada canal FP. Utilice un láser de argón para excitar CFP a 458 nanómetros y YFP a 514 nanómetros, y utilice un láser de nanómetro DPSS 561 para excitar el dTomato. Recoge las misiones para los tres en las longitudes de onda apropiadas.Seleccione el rango de pila Z para la imagen y un intervalo de tiempo entre 10 y 30 minutos para realizar un seguimiento de los eventos mitoticos y apoptóticos. Por último, seleccione la duración de la sesión de imágenes y ejecute el experimento. Una vez completada la creación de imágenes, guarde los datos sin procesar en formato CZI si utiliza Zen u otro formato compatible con Fiji y, a continuación, importe las imágenes en Fiji utilizando el importador de formatos biológicos.Las imágenes de lapso de tiempo multicolor in vivo se utilizaron para mostrar clones codificados por color Brainbow de células en la zona ventricular proliferativa del cerebro trasero del pez cebra en desarrollo. Las células etiquetadas brainbow dispuestas a lo largo de una fibra radial en particular compartían el mismo color. Que se pueden cuantificar como los pesos de canal RGB relativos.Esto sugiere que estos grupos de radio eran clones de células divisorias y que su color similar podría ser utilizado para identificarlos como relacionados clonalmente. Un análisis cuantitativo del color mostró que las células hijas expresan el mismo color que la célula de su madre. Pero los grupos de radio vecinos de células se pueden distinguir entre sí.Numerosos clones de células relacionadas se pueden seguir simultáneamente durante horas in vivo, lo que permite un análisis y comparación de linaje multiplex. La cuantificación de la expresión del color en los clones a los dos y luego de nuevo a los tres días después de la fertilización mostró que la expresión de Brainbow se mantuvo relativamente constante de dos a tres días. Las imágenes de lapso de tiempo revelaron numerosas células sometidas a migración nuclear intercinética y división celular de uno a dos días después de la fertilización, lo que permite estudiar el ciclo celular.Se calculó un ciclo celular promedio de 8,4 horas que es comparable a las mediciones anteriores en peces cebra. Además, esta técnica de imagen se utilizó para observar células individuales sometidas a los cambios morfológicos estereotipados asociados con la apoptosis, como el sangrado de membranas y la fragmentación celular. Debido a que este método se realiza in vivo, el pez cebra puede ser rescatado de la cámara de imágenes y mantenido para imágenes u otros experimentos en puntos de tiempo posteriores.El uso de esta técnica nos permite explorar nuevas preguntas sobre los roles de las células relacionadas clonalmente durante el desarrollo neuronal.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Abstract