ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Summary

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

Abstract

ליפידים הם מולקולות אמפיפתיים מגוונות האינן משונות במים. שומנים הם תורמים חיוניים לארגון ולתפקוד של ממברנות ביולוגיים, אחסון אנרגיה וייצור, איתות סלולרי, הובלה והעברה של חלבונים, ארגונית biogenesis, מוסדרות מוות תאים. בגלל שמרים להתחש סכביסים cerevisiae ס הוא חד חד-תאי איקריוטים לניתוח מולקולרי יסודית, השימוש בו כאורגניזם מודל עזר לחשוף מנגנונים המקשרים חילוף החומרים ליפיד ותחבורה תאיים לתהליכים ביולוגיים מורכבים בתוך תאים איקריוטית. הזמינות של שיטה אנליטית רב-תכליתית להערכה הכמותית האיתנה, הרגישה והמדויקת של מחלקות שומנים גדולות בתוך תא שמרים, חיונית לקבלת תובנות עמוקות במנגנונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתמש כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה מאסיבית (LC-MS/MS) עבור ניתוח כמותי של שומנים סלולריים מרכזיים של S. cerevisiae. שיטת LC-MS/MS המתוארת היא מגוונת ואיתנה. היא מאפשרת זיהוי וקוונפיקציה של מינים רבים (כולל צורות isobaric או איזואריק שונים) בתוך כל אחד 10 שיעורי השומנים. שיטה זו היא רגישה ומאפשרת זיהוי וכימות של כמה מינים שומנים בריכוזים נמוך כמו 0.2 pmol/μL. השיטה הוחלה בהצלחה על הערכת כיפות של תאי שמרים שלמים והאורגלים הטהרה שלהם. השימוש בתוספים אלטרנטיביים בשלב הנייד עבור הספקטרומטר ההמוני הגדול בשיטה זו יכול להגביר את יעילות האינון עבור מינים מסוימים של השומנים, ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לשפר את הזיהוי והכמת שלהם.

Introduction

גוף של ראיות מציין כי שומנים, אחת המחלקות הגדולות של biomolecules, לשחק תפקידים חיוניים בתהליכים חיוניים רבים בתוך תא איקריוטית. תהליכים אלה כוללים את ההרכבה של bilayers השומנים המהווים את קרום פלזמה וממברנות המקיפים אורגלים סלולריים, הובלה של מולקולות קטנות על פני ממברנות התא, תגובה שינויים בסביבה החילוץ והתמרה האות תאיים, הדור והאחסון של אנרגיה, ייבוא וייצוא של חלבונים מוגבלים אורגלים שונים, סחר בסמים של חלבונים בתוך מערכת endomembrane הפרשת חלבון, ומספר מצבים של מוות תא מוסדר^{1 ,2,3,4,5,}

Protocol

1. הכנת מדיה סטרילית לשמרים מפני שמרים

1. להכין 90 mL של מדיום מלאה YP המכיל 1% (w/v) תמצית שמרים 2% (w/v) bactopeptone.
2. הכינו 90 mL של בינוני סינתטי מינימלי YNB המכיל 0.67% (w/v) שמרים חנקן בסיס ללא חומצות אמינו, 20 מ"ג/L l-histidine, 30 מ"ג/l l-leucine, 30 מ"ג/l ל-ליזין, ו 20 מ"ג/l uracil.
3. חילוק 90 mL של מדיום מלאה YP באופן שווה לתוך 2 250 mL Erlenmeyer אייר צלוחיות (כלומר, 45 mL כל אחד).
4. חלוקת 90 mL של המדיום הסינתטי YNB מינימלי לתוך 2 250 mL Erlenmeyer מבחנות (כלומר, 45 mL כל אחד).
5. להפעיל את מבחנות עם מדיה YP ו-YNB ב 15 psi/121 ° צ' עבור 45 דקות לפני השימוש.

2....

Discussion

אמצעי הזהירות הבאים חשובים ליישום המוצלח של הפרוטוקול המתואר כאן:

1. כלורופורם ומתנול רעילים. הם מחלצים ביעילות חומרים שונים ממשטחים, כולל פלסטלינה, מעבדה ועור. לכן, לטפל אלה ממיסים אורגני עם זהירות על ידי הימנעות השימוש בפלסטיק בשלבים הכרוכים במגע עם כלורופורם ו/או מתנול, ב?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps	PYREX	05-550
2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
2-Propanol	Fisher Scientific	A461-500
Acetonitrile	Fisher Scientific	A9554
Agilent 1100 series LC system	Agilent Technologies	G1312A
Agilent1100 Wellplate	Agilent Technologies	G1367A
Ammonium acetate	Fisher Scientific	A11450
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550
Ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A470-250
Bactopeptone	Fisher Scientific	BP1420-2
Cardiolipin	Avanti Polar Lipids	750332
Centra CL2 clinical centrifuge	Thermo Scientific	004260F
Ceramide	Avanti Polar Lipids	860517
Chloroform	Fisher Scientific	C297-4
CSH C18 VanGuard	Waters	186006944	Pre-column system
Free fatty acid (19:0)	Matreya	1028
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM)	Sigma-Aldrich	G8772
Glucose	Fisher Scientific	D16-10
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
L-histidine	Sigma	H8125
Lipid Search software (V4.1)	Fisher Scientific	V4.1	LC-MS/MS analysis software
L-leucine	Sigma	L8912
L-lysine	Sigma	L5501
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	850340
Phosphatidylethanolamine	Avanti Polar Lipids	850704
Phosphatidylglycerol	Avanti Polar Lipids	840446
Phosphatidylinositol	Avanti Polar Lipids	LM1502
Phosphatidylserine	Avanti Polar Lipids	840028
Reverse-phase column CSH C18	Waters	186006102
Sphingosine	Avanti Polar Lipids	860669
Thermo Orbitrap Velos MS	Fisher Scientific	ETD-10600
Tricylglycerol	Larodan, Malmo	TAG Mixed FA
Ultrasonic sonicator	Fisher Scientific	15337416
Uracil	Sigma	U0750
Vortex	Fisher Scientific	2215365
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-2
Yeast nitrogen base without amino acids	Fisher Scientific	DF0919-15-3
Yeast strain BY4742	Dharmacon	YSC1049