Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

Abstract

ליפידים הם מולקולות אמפיפתיים מגוונות האינן משונות במים. שומנים הם תורמים חיוניים לארגון ולתפקוד של ממברנות ביולוגיים, אחסון אנרגיה וייצור, איתות סלולרי, הובלה והעברה של חלבונים, ארגונית biogenesis, מוסדרות מוות תאים. בגלל שמרים להתחש סכביסים cerevisiae ס הוא חד חד-תאי איקריוטים לניתוח מולקולרי יסודית, השימוש בו כאורגניזם מודל עזר לחשוף מנגנונים המקשרים חילוף החומרים ליפיד ותחבורה תאיים לתהליכים ביולוגיים מורכבים בתוך תאים איקריוטית. הזמינות של שיטה אנליטית רב-תכליתית להערכה הכמותית האיתנה, הרגישה והמדויקת של מחלקות שומנים גדולות בתוך תא שמרים, חיונית לקבלת תובנות עמוקות במנגנונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתמש כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה מאסיבית (LC-MS/MS) עבור ניתוח כמותי של שומנים סלולריים מרכזיים של S. cerevisiae. שיטת LC-MS/MS המתוארת היא מגוונת ואיתנה. היא מאפשרת זיהוי וקוונפיקציה של מינים רבים (כולל צורות isobaric או איזואריק שונים) בתוך כל אחד 10 שיעורי השומנים. שיטה זו היא רגישה ומאפשרת זיהוי וכימות של כמה מינים שומנים בריכוזים נמוך כמו 0.2 pmol/μL. השיטה הוחלה בהצלחה על הערכת כיפות של תאי שמרים שלמים והאורגלים הטהרה שלהם. השימוש בתוספים אלטרנטיביים בשלב הנייד עבור הספקטרומטר ההמוני הגדול בשיטה זו יכול להגביר את יעילות האינון עבור מינים מסוימים של השומנים, ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לשפר את הזיהוי והכמת שלהם.

Introduction

גוף של ראיות מציין כי שומנים, אחת המחלקות הגדולות של biomolecules, לשחק תפקידים חיוניים בתהליכים חיוניים רבים בתוך תא איקריוטית. תהליכים אלה כוללים את ההרכבה של bilayers השומנים המהווים את קרום פלזמה וממברנות המקיפים אורגלים סלולריים, הובלה של מולקולות קטנות על פני ממברנות התא, תגובה שינויים בסביבה החילוץ והתמרה האות תאיים, הדור והאחסון של אנרגיה, ייבוא וייצוא של חלבונים מוגבלים אורגלים שונים, סחר בסמים של חלבונים בתוך מערכת endomembrane הפרשת חלבון, ומספר מצבים של מוות תא מוסדר1 ,2,3,4,5,

Protocol

1. הכנת מדיה סטרילית לשמרים מפני שמרים

  1. להכין 90 mL של מדיום מלאה YP המכיל 1% (w/v) תמצית שמרים 2% (w/v) bactopeptone.
  2. הכינו 90 mL של בינוני סינתטי מינימלי YNB המכיל 0.67% (w/v) שמרים חנקן בסיס ללא חומצות אמינו, 20 מ"ג/L l-histidine, 30 מ"ג/l l-leucine, 30 מ"ג/l ל-ליזין, ו 20 מ"ג/l uracil.
  3. חילוק 90 mL של מדיום מלאה YP .......

Representative Results

השיטה שלנו להערכה כמותית של שומנים סלולריים מרכזיים בתוך תא שמרים בעזרת LC-MS/MS היה רב-תכליתי וחסון. זה איפשר לנו לזהות ולכמת 10 שיעורים שונים ליפיד בתאי S. cerevisiae ס תרבותי במדיום הסינתטי מינימלי ynb מכיל בתחילה 2% גלוקוז. שיעורי השומנים הללו כוללים חומצות שומן בחינם (FFA), קלר.......

Discussion

אמצעי הזהירות הבאים חשובים ליישום המוצלח של הפרוטוקול המתואר כאן:

1. כלורופורם ומתנול רעילים. הם מחלצים ביעילות חומרים שונים ממשטחים, כולל פלסטלינה, מעבדה ועור. לכן, לטפל אלה ממיסים אורגני עם זהירות על ידי הימנעות השימוש בפלסטיק בשלבים הכרוכים במגע עם כלורופורם ו/או מתנול, ב?.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה לחברים הנוכחיים ולשעבר של מעבדת טיטורנקו לדיונים. אנו מכירים את המרכז ליישומים ביולוגיים של המסה ספקטרומטריה והמרכז לגנומיקה מבנית ופונקציונלית (הן באוניברסיטת קונקורדיה) עבור שירותים יוצאי דופן. מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מדעי הטבע והמועצה למחקר הנדסי (NSERC) של קנדה (RGPIN 2014-04482) ו האוניברסיטה האוניברסיטאי קונקורדיה קרן (CC0113). ק היה נתמך על ידי פרס הצטיינות באוניברסיטת קונקורדיה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined capsPYREX05-550
2 mL Glass sample vials with Teflon lined capsFisher Scientific60180A-SV9-1P
2-PropanolFisher ScientificA461-500
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Agilent 1100 series LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Agilent1100 WellplateAgilent TechnologiesG1367A
Ammonium acetateFisher ScientificA11450
Ammonium bicarbonateSigma9830
Ammonium formateFisher ScientificA11550
Ammonium hydroxideFisher ScientificA470-250
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
CardiolipinAvanti Polar Lipids750332
Centra CL2 clinical centrifugeThermo Scientific004260F
CeramideAvanti Polar Lipids860517
ChloroformFisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardWaters186006944Pre-column system
Free fatty acid (19:0)Matreya1028
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM)Sigma-AldrichG8772
GlucoseFisher ScientificD16-10
HemacytometerFisher Scientific267110
L-histidineSigmaH8125
Lipid Search software (V4.1)Fisher ScientificV4.1LC-MS/MS analysis software
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
PhosphatidylcholineAvanti Polar Lipids850340
PhosphatidylethanolamineAvanti Polar Lipids850704
PhosphatidylglycerolAvanti Polar Lipids840446
PhosphatidylinositolAvanti Polar LipidsLM1502
PhosphatidylserineAvanti Polar Lipids840028
Reverse-phase column CSH C18Waters186006102
SphingosineAvanti Polar Lipids860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
TricylglycerolLarodan, MalmoTAG Mixed FA
Ultrasonic sonicatorFisher Scientific15337416
UracilSigmaU0750
VortexFisher Scientific2215365
Yeast extractFisher ScientificBP1422-2
Yeast nitrogen base without amino acidsFisher ScientificDF0919-15-3
Yeast strain BY4742DharmaconYSC1049

References

  1. Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
  2. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157glycerophospholipidsceramideslipidomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved