Поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и Ex vivo Характеристика опухоли-проникновения T клеточной цитотоксичности

In vivo модели рака поджелудочной железы предоставляют бесценные инструменты для изучения динамики заболеваний, иммунной инфильтрации и новых терапевтических стратегий. Ортотопическая моуринная модель может быть выполнена на больших когортах иммунокомпетентных мышей одновременно, является относительно недорогой и сохраняет коньяк ткани микроокружения. Количественная оценка инфильтрации Т-клеток и цитотоксическая активность в ортотопических опухолях является полезным показателем противоопухолевого ответа.

Этот протокол описывает методологию хирургического поколения ортотопических опухолей поджелудочной железы путем инъекций низкого числа сингенных опухолевых клеток, перевезненных в мембране подвала 5 Л непосредственно в поджелудочную железу. Мыши подшипник ортотопических опухолей занять около 30 дней, чтобы достичь конечной точки, в этот момент опухоли могут быть собраны и обработаны для характеристики опухоли инфильтрации Т-клеток деятельности. Быстрое ферментативное пищеварение с помощью коллагеназы и DNase позволяет извлекать одноклеточную суспензию из опухолей. Сохраняется жизнеспособность и маркеры поверхности клеток иммунных клеток, извлеченных из опухоли; Поэтому, это подходит для нескольких приложений вниз по течению, в том числе поток-помощь клеток сортировки иммунных клеток для культуры или экстракции РНК, циклометрический анализ потока иммунных клеток населения. Здесь мы описываем ex vivo стимуляцию популяций Т-клеток для внутриклеточной количественной оценки цитокинов (IFN и TNF) и дегранизационной активности (CD107a) как меру общей цитотоксичности. Цельноопухолевые дайджесты стимулировались ацетатом phorbol myristate и иомамицином на 5 ч, в присутствии анти-CD107a антитела для того, чтобы upregulate производства цитокинов и дегранизывания. Добавление брефельдина А и монэнсина для финальных 4 ч было выполнено для блокирования внеклеточного транспорта и максимального обнаружения цитокинов. Вне- и внутриклеточного окрашивания клеток затем было выполнено для анализа цитометрии потока, где пропорция IFN^,TNF^и CD107a^{- CD4} и CD8^- Т-клеток была количественно.

Этот метод обеспечивает стартовую основу для проведения всестороннего анализа микросреды опухоли.