Biz Dr Omaida C. Velazquez (University of Miami) yararlı işbirliği, danışma ve tartışma için teşekkür ederiz; Dr Jie Li (University of Miami) MeWo hücreleri sağlamak için; ve Dr Meenhard Herlyn (Wistar Enstitüsü) diğer tüm melanom hücreleri sağlamak için. Ayrıca Dr Marcia Boulina, Analitik Görüntüleme Çekirdek Tesisi Direktörü, Miami Üniversitesi, görüntüleme analizi için teşekkür ederiz. Zhao-Jun Liu Bankhead-Coley Kanser Araştırma Programı (Ödül # 09BN-11), Kadın Kanser Derneği(53 yıllık hibe) ve Miami Üniversitesi'nden iç fonlar hibe tarafından desteklendi.

1. Culturing Melanom Hücreleri ve Cilt Fibroblastları
<ol><li>Culturing insan melanom hücreleri<ol>
<li>Kültür insan melanom hücreleri, C816131 tam W489 orta konvansiyonel yapışık hücre kültürü koşulları altında (adım 1.2 bakınız) 37 ° C inkübatör ile birlikte 5% CO2 daha önce açıklandığı gibi32. Hücreleri ~%90 birleşimlerine ulaştıklarında 1:5 oranında bölün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Melanom hücre kültürü orta (W489)<ol>
<li>Tam W489 orta için % 80 MCDB153 orta, %20 L-15 orta (Bkz. Malzemeler Tablosu),%2 fetal büyükbaş serum (FBS), 5 g/mL insülin, 1,68 mM CaCl2ve %0,11 sodyum bikarbonat kullanın. Coculture için, FBS, insülin ve CaCl2eklemeyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare cilt fibroblast izolasyon<ol>
<li>Kurumun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) ilgili yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak fareden 1 cm x 1 cm deri parçası kesin.</li>
		<li>Bir gecede 4 °C'de cildi dispase ile sindirin (Bkz. Malzeme Tablosu). Dermisi epidermisten sıyırın ve kollajenazla daha fazla sindirimi (DMEM'de 1 mg/mL, bkz. Malzeme Tablosu)gece oda sıcaklığında (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare cilt fibroblast kültür<ol>
<li>Doku peletlerini PBS ile yıkayın ve DMEM'de %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile 37 °C/5% CO2'dekültürleyin. Hücreleri ~%90 birleşimlerine ulaştıklarında 1:2 oranında bölün.</li>
		<li>Cilt fibroblastlarını gfp/lentivirus ile birlikte kültürden önce standart yöntemlerle aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İmmünoboyama ile fare derisi fibroblastlarının karakterizasyonu<ol>
<li>Boyama için hücre hazırlığı<ol>
<li>2 x 104 hücre/kuyu yoğunluğunda 24 iyi plaka deri fibroblastlar tohum. 2. günde, hücreleri PBS 2x ile yıkayın ve 10 dakika boyunca %2 nötr tamponlu formalin le düzeltin. formalini çıkarın ve sabit hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İmmünoboyama<ol>
<li>Her kuyuya 200 μL bloklama çözeltisi ekleyin ve plakayı RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından 1:200'de seyreltilmiş fare anti-α-SMA ekleyin ve 37 °C'de 1 saat boyunca 1 saat boyunca inküterdirin.</li>
			<li>1:400 seyreltme de Alex Fluor 488 keçi anti-fare IgG ekleyin ve 1 saat için RT inkübat.</li>
			<li>2 dk. DAPI çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 500 μL PBS ekleyin.</li>
			<li>Hücreleri gözlemleyin ve ters floresan mikroskobu kullanarak fotoğraf çekmek.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prelabelling fibroblastlar ve melanom hücreleri<ol>
<li>Tohum fibroblastlar 1. 2. gün, kültür ortamını kaldırın ve 4 μg/mL polibrene ile düzenli kültür ortamına GFP/lentivirus (stoktan seyreltilmiş~1:3-1:5) ekleyin. 37 °C'lik bir kuluçka makinesindeki hücreleri 6 saat boyunca inkübün, ortayı çıkarın ve taze normal kültür ortamıyla değiştirin. 2 gün sonra, floresan mikroskobu kullanarak hücrelerden gelen GFP sinyalini gözlemleyin. Benzer koşullar altında DsRed/lentivirus içeren C8161 hücrelerini iletin. GFP/lentivirus ve DsRed/lentivirus hazırlanması için protokoller daha önce tarif edilmiştir14,34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hücre Coculture
<ol><li>Tohum C8161-fibroblast coculture.<ol>
<li>Küresel formasyon teşrisinin 0. Hücreleri 250 g'da RT'de 5 dk'da aşağı doğru çevirin ve PBS ile bir kez yıkayın.</li>
		<li>Hücre kokültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın (serumsuz, insülinsiz ve kalsiyumsuz W489 ortamı serumsuz DMEM ile 1:1 oranında karıştırılarak). Hücre konsantrasyonu 2 x 104 hücre/mL olarak ayarlayın.</li>
		<li>C8161 hücrelerini 1:1 oranında fibroblastlarla karıştırın ve 24 kuyunun her kuyunun her kuyuya hücre karışımlarından 2 mL ekleyin. Her kuyu, her hücre türünden 2 x 104 içermelidir. Her durum triplicate yapılmalıdır. NOT: Doku dışı bir kültür emdirilen plaka kullanmak önemlidir (bkz. Malzeme Tablosu). Aksi takdirde, hücreler güçlü bir plaka eklemek ve küresel askıya mümkün olmayacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreler tabağa bağlanana kadar 37 °C'de 4 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın ve her bir töz için belirtilen zaman noktalarında hızlandırılmış görüntüleme veya konfokal tarama yapın.</li>
</ol>3. Canlı Hücre Zaman Atlamalı Görüntüleme
<ol><li>Coculture önce, üreticinin talimatları na göre hızlandırılmış görüntüleme sistemini açın (Malzemeler Tablosubakınız) ve kuluçka makinesinin 37 °C ve %5 CO2'ye ulaşmasınaizin verin. Sistemin dengeye ulaşması genellikle 1 saat sürer. Kültür plakasını dikkatlice mikroskop un sahnesine kuvözün içine yerleştirin ve kapıyı güvenli bir şekilde kilitleyin.</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntüleme sisteminin yazılımını açın (Bkz. Malzeme Tablosu)ve mikroskopun tarama alanını doğru bir şekilde bulabilmeleri için plaka türünü ve üreticiyi seçin. Ilgi kuyuları ve 10x objektif lens seçin. Tarama alanının ayarlarını, taramalar arasındaki aralık süresini ve bitiş süresini seçin. Bu protokolde, 1 kuyu için tarama alanı için maksimum biçim numarası 36 ve aralık süresi 1 saattir.</li>
	<li>4-52 saat arasında hızlandırılmış görüntüleme kaydedin. NOT: Başlangıç zamanı, bitiş süresi ve süresi hücre türüne ve denemenin amacına göre optimize edilmelidir.</li>
	<li>Görüntü kaydını tamamlarken, verileri almak ve video veya görüntü kümelerini dışa aktarmak için hızlandırılmış görüntüleme sistemi yazılımını kullanın.</li>
</ol>4. Konfokal Mikroskopi ve 3D Filmler
<ol><li>Hücre kokültür plakasını ters floresan mikroskobun sahnesine yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu)ve kırmızı ve yeşil lazer ışınları kullanın. 5x veya 10x objektif lens altında hücreleri gözlemleyin ve tarama başlatmak için bir küresel seçin.</li>
	<li>Küresel oidin alttan üstüne kadar tatmak için 1 μm z-adım kullanın. Daha fazla döndürülebilen ve 3B film olarak kaydedilebilen bir 3B görüntüyü yeniden oluşturmak için görüntü işleme yazılımını kullanarak verileri işleme (Bkz. Malzeme Tablosu)</li>
</ol>5. Melanom Hücrelerinin Yalnız Kültürü ve 2B Kümelerin/Agregaların Oluşumu
<ol><li>Tohum 2 x 104 C8161 melanom hücrelerinin her bir kuyuiçine 24 kuyu plaka bölüm 2.1 açıklandığı gibi. 7-10 gün boyunca hücreleri kültürve ters floresan mikroskop kullanarak fotoğraflayın.</li>
</ol>6. 3D Küreseller ve 2B Hücre Kümelerinin/Agregalarının Orta alanda Asılı olup olmadığını veya Plakalara Bağlı Olup Olmadığını Kontrol Etme
<ol><li>Hücre eşkültürü için, 7. Tek hücreli kültür için, 10.</li>
	<li>Hücre kültür plakalarını ters floresan mikroskobun platformuna yerleştirin. Bir şırınga ile bükülmüş bir iğneyi kuyuya koyun ve kuyudaki kültür ortamını rahatsız etmek için kültür ortamını hafifçe aspire edin. Bu işlemi film yazılımının film modunu kullanarak kaydedin (bkz. Malzeme Tablosu). 3D küreseller hareketli olacak, ancak 2B hücre kümeleri/agregaları sabit kalacaktır.</li>
</ol>7. 3D Spheroidlerin Konfokal Görüntüsü
NOT: Kolkültürlü hücreler kullanılan fibroblastların tipine bağlı olarak 48-72 h arasında küresel form oluşturmaya başlarlar. Genellikle, sheroidler zamanla yavaş yavaş büyür. Küçük küreseller 7. Küresel ler boyut olarak stabilize edildikten sonra 10 günden fazla sürebilirler. Bundan sonra, küreseller genellikle kültür plakasının altından ayırmak ve kuyuların merkezinde bir araya. Küresel lerin genişlemesi sırasında, merkezdeki hücreler genellikle yetersiz beslenme ve / veya toksik mikroçevre nedeniyle ölür. Bu nedenle, 3D küresel oluşumu ve olgunlaşmış küresel görüntü zamanlaması zirve pilot deneyler kullanılarak optimize edilmelidir. Bu protokol için, splofoidlerin olgun olduğu ve küreseloidlerin merkezindeki hücrelerin merkezdeki hücrelerin floresan ve morfolojisine göre hala hayatta olduğu 7.
<ol><li>Konfokal mikroskopi yapmak için, küresel leri tarayabilmek için yeşil ve kırmızı lazer kullanın. Tarama alanını 10x hedefi altında belirleyin ve 1 μm z-adımla küresel oidin alttan üstüne doğru hareket edin.</li>
	<li>Görüntü işleme yazılımının (örneğin, ImageJ) 3D projeksiyon işlevini kullanarak 3B küresel formasyon ve döndürme videolarını oluşturun.</li>
</ol>8. Kanser Kökünün Stromal Regülasyonunun Belirlenmesinde Hücre İçi Çentik1 Sinyal Yolu Aktivitesi/İnisyon Hücreleri
<ol><li>Cilt fibroblastlarının fonksiyon artışı ve kaybı Ndan izolasyon ve karakterizasyonu Çentik1 fareler<ol>
<li>Genetik olarak modifiye edilmiş iki çift fareden deri fibroblastlarını izole edin: Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+fareler karşı muadili kontrolü (GOFctrl : FSP1. Kre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) fareler ve Fonksiyon Kaybı Çentik1 (LOFÇentik1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+fareler karşı muadili kontrolü (LOFctrl : FSP1. Kre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) farelerivedisi 31,sırasıyla. Bölüm 1.3-1.5'te açıklanan protokolü kullanarak deri fibroblastlarını izole edin ve karakterize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GFP/lentivirus ile fare derisi fibroblastları ile transduce.<ol>
<li>Lentiviral vektör ile hücreleri iletme yöntemi için bölüm 1'e bakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fibroblastlar ve melanom hücrelerinin coculture<ol>
<li>Bölüm 2'de açıklandığı gibi hücre ortakkültür deneyini gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D sferoidlerin boyutlarını ölçerek kanser kök/başlatan hücrelerin stromal regülasyonunun belirlenmesinde fibroblastlarda hücre içi Notch1 yol aktivitesinin etkisinin değerlendirilmesi<ol>
<li>Küresellerin olgunlaştığı anda küresel lerin fotoğrafını çekerek her koşulda küresel formasyonun niceliğini gerçekleştirin (fibroblast türlerine bağlı olarak 5-7. gün civarında büyümenin durması ile gösterilir). Görüntü işleme yazılımını kullanarak 3B küresellerin boyutlarını ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 3D Sferoid Testi Kullanarak Kanser Kök / Başlatan Hücrelerin İlaç Yanıtı Test
NOT: CAF kanser heterojenitesini düzenleyebilir ve kanser kök /başlatan hücrelerin fenotip neden olabilir. CAF da kanser kök / klinik tedavilere katlanmak için hücreleri başlatan destek. Kanser kök hücrelerinin ilaç direncine karşı sorumlu olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu 3D sferoid modeli kanser kök / başlatan hücrelerin ilaç yanıtını değerlendirmek için kullanılır. Sonuç iyi anti-kanser ilaç potansiyel klinik etkinliğini değerlendirebilirsiniz.
<ol><li>İlaç yönetimi<ol>
<li>24 kuyu plakasındaki hücreleri bir arada kullandıktan hemen sonra, pilot deneylere (yani, 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM ve 25 nM) istenilen konsantrasyon aralığının 5 x'ine ulaşmak için ilaçları kültür ortamında seri seyreltme halinde hazırlayın. Cokültürd hücrelerin her kuyuya karşılık gelen ilaç çözümleri 0,5 mL ekleyin. Kontrol grubunu yukarıda belirtildiği gibi düzenli eşkültür medyası ile tedavi edin.</li>
		<li>NOT: MEK inhibitörü hücre kültürü ortamlarında çözünür. Bu nedenle, boş denetimler hücre kültürü ortamının 2,5 mL'sidir. Ancak, ilaç sulu çözeltide çözünmezse ve DMSO gibi çözücüler gerektiriyorsa, aynı DMSO konsantrasyonuna sahip hücre kültürü ortamı kontrol grubuna uygulanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Küresel leri sayarak ilaç yanıtının sayısallaştırılması<ol>
<li>Bir floresan mikroskobu kullanarak tedavi edilen hücreleri ve tedavi edilmeyen hücreleri gözlemleyin ve her gün hücrelerin fotoğrafını izleyin. Farklı deney gruplarındaki küresel oluşumu ölçün ve farklı ilaç konsantrasyonları altında hücre kültürlerinin küresel oluşum yeteneğini karşılaştırın. NOT: Küreseller birlikte kültürden ~5−7 gün sonra ortaya çıkma eğilimindedirler. İlaç etkileri o zaman noktada fark edilecektir.</li>
		<li>Kuyularda bulunan küresel hücreleri görüntülemek/fotoğraflamak için floresan mikroskobu kullanın ve daha sonra zaman içinde her tedavi grubunda düşük güç alanı başına oluşan küreseloidlerin ortalama boyutunu ve küresel sayıları hesaplamak için görüntü yazılımını kullanın. NOT: Etkili ilaç tedavisi alan hücreler kontrol grubuna göre daha az veya hiç küresel spheroid oluşturmalıdır. Bu kanser kök hücreleri bastırma üzerinde test ilacın etkinliğinin bir göstergesidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1091-1103 (2008).</li><li>Anton, K., Glod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+stroma+in+cancer+therapy.">Targeting the tumor stroma in cancer therapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, 185-191 (2009).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501, 346-354 (2013).</li><li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer.">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Lynch, C. C., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+in+tumor-host+cell+communication.">Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication.</a> Differentiation. 70, 561-573 (2002).</li><li>Midwood, K. S., Williams, L. V., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+repair+and+the+dynamics+of+the+extracellular+matrix.">Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 36, 1031-1037 (2004).</li><li>Olumi, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+direct+tumor+progression+of+initiated+human+prostatic+epithelium.">Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium.</a> Cancer Research. 59, 5002-5011 (1999).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5, 1597-1601 (2006).</li><li>Luga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+mediate+stromal+mobilization+of+autocrine+Wnt-PCP+signaling+in+breast+cancer+cell+migration.">Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration.</a> Cell. 151, 1542-1556 (2012).</li><li>Zhang, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+bone+metastasis+seeds+by+mesenchymal+signals+in+the+primary+tumor+stroma.">Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma.</a> Cell. 154, 1060-1073 (2013).</li><li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch1+signaling+in+stromal+fibroblasts+inhibits+melanoma+growth+by+upregulating+WISP-1.">Activation of Notch1 signaling in stromal fibroblasts inhibits melanoma growth by upregulating WISP-1.</a> Oncogene. 30, 4316 (2011).</li><li>Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+Antitumor+Immune+Response+by+Cancer-Associated+Fibroblasts.">Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts.</a> Frontier in Immunology. 9, 414 (2018).</li><li>Kraman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+antitumor+immunity+by+stromal+cells+expressing+fibroblast+activation+protein-alpha.">Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha.</a> Science. 330, 827-830 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery.">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2007).</li><li>Santiago-Walker, A., Li, L., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocytes:+from+morphology+to+application.">Melanocytes: from morphology to application.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 22, 114-121 (2009).</li><li>Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+melanoma+in+vitro+and+in+vivo.">Modeling melanoma in vitro and in vivo.</a> Healthcare (basel). 2, 27-46 (2013).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+flow+cytometry-based+analysis+of+cell+position+and+the+cell+cycle+in+3D+melanoma+spheroids.">Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17, 1-15 (2015).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society Interface. 14, (2017).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31, 108-115 (2013).</li><li>Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery.">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).</li><li>Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+high-throughput+image+analysis+for+therapeutic+efficacy+of+architecturally+complex+heterotypic+organoids.">Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids.</a> Scientific Reports. 7, 16645 (2017).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroid+based+on+a+triple+coculture:+A+novel+3D+model+to+mimic+pancreatic+tumor+complexity.">Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity.</a> Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).</li><li>Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Gu, L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+emerging+anticancer+therapeutics:+engineering+the+microenvironment.">Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment.</a> Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).</li><li>Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedded+Spheroids+as+Models+of+the+Cancer+Microenvironment.">Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment.</a> Advanced Biosystems. 1, (2017).</li><li>Welch, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+highly+invasive+and+spontaneously+metastatic+human+malignant+melanoma+cell+line.">Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).</li><li>Balint, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch1+signaling+is+required+for+beta-catenin-mediated+human+primary+melanoma+progression.">Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Notch1+Signaling+in+Cancer-Associated+Fibroblasts+Dictates+the+Plasticity+and+Stemness+of+Melanoma+Stem/Initiating+Cells.">Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells.</a> Stem Cells. 37, 865-875 (2019).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+Pathway+Activity+Determines+the+Regulatory+Role+of+Cancer-Associated+Fibroblasts+in+Melanoma+Growth+and+Invasion.">Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion.</a> PLoS One. 10, 0142815 (2015).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1-WISP-1+axis+determines+the+regulatory+role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+stromal+fibroblasts+in+melanoma+metastasis.">Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis.</a> Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).</li><li>Kalluri, R., Neilson, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+and+its+implications+for+fibrosis.">Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).</li><li>Price, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+models+in+immunodeficient+animals+:+I.+Nude+mice:+spontaneous+and+experimental+metastasis+models.">Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models.</a> Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).</li><li>Spaeth, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS One. 4, 4992 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

In vitro 3D hücre kültürü teknikleri yaygın kanser araştırmalarında yıllardır kullanılmaktadır. Konvansiyonel 2B hücre kültür sistemleri ile karşılaştırıldığında, 3D mikroçevre hücre-hücre ve/ veya hücre-matris etkileşimleri recapitulates ve tümör dokularında gözlenen gerçek koşulları taklit sağlar. Ancak, sadece kanser hücreleri ve homotipik hücre-hücre etkileşimleri tarafından oluşturulan bir 3D sistemi heterotipik çapraz konuşmanın önemini hesaba katmaz ve araştırmalarda yanlış sonuçlar verebilir. Biz son zamanlarda daha iyi in vivo heterojen tümör mikroçevre ve yerli ve sert desmoplastik reaksiyon taklit etmek için kanser hücreleri ve CAF birleştiren yeni bir 3D sistem geliştirdik.
Fibroblastlar tümör stromasının başlıca bileşenleridir. CAF çözünür faktörler, ECM / remodeling enzimler10,11ve ekzozomlar ortaya çıkararak tümör ilerlemesini düzenleyen yer almaktadır. Ayrıca, CAF ilaç direnci ve tümör nüks bir rol oynamaktadır16,17. Çok hücreli 3D küresel sistemimiz tümör-stromal etkileşimlerin moleküler mekanizmalarını araştırmak ve ilaç direnci ve tümör nüksüne çözüm bulmak için kullanılabilir. CAF öncelikle aktif lokal quiescent fibroblastlar ve tümör dokusu nda CAF içine yerinde farklılaşma geçmesi kemik iliği MSC, işe alınan türetilmiştir37,38,39. Mevcut çalışmada, çok hücreli 3D küresel bir model oluşturmak için deri fibroblastları kullanılır. Ancak, fibroblastlar diğer tip (örneğin, MSC-DF), aynı zamanda tümör hücresi 3D sfaoid oluşumunu düzenlemek için deri fibroblastlar gibi çok benzer bir şekilde çalışır34. MSC-DF, MSC hücre kültürü orta bölgesinde kemik iliği mononükleer hücrelerinin yaklaşık 10 gün boyunca her 3 günde bir periyodik orta değişikliklerle kültüre alınmasıyla zenginleştirilmiş olan murin kemik iliği MSC'sinden üretilebilir. Bu MSC CD73+/CD105+/Lin-olarak karakterize edilir. MSC'yi fibroblastlara ayırmak için MSC daha sonra tam 2 hafta boyunca tam DMEM ile kültürlenir. MSC-DF α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ hücreler36olarak karakterize edilir. MSC-DF önemli tümör düzenleyicileri olabilir. Katı tümörlerin birçok türünde CAF bir kısmını kemik iliği36salınan işe dolaşan msc ayırt edilir çünkü, MSC-DF tedavi hedefleri umut verici olabilir. Onlar da çok daha kolay terapötik manipüle veya hedef önce tümör dokularına işe ve CAF içine farklılaşmış. Böylece, bizim 3D modeli çalışma ve sadece kanser hücrelerini test etmek için ideal bir sistem sunuyor, ama aynı zamanda farklı kesirler veya CAF alt popülasyonları. 3D küresel formasyon yöntemi basittir. Kritik adımlar arasında kokültür için serumsuz ortam kullanılması, tümör hücrelerine doğru fibroblast oranının uygulanması ve kokültür için doğru kültür plakalarının kullanılması yer almaktadır. Yöntemimizin potansiyel sınırlaması 3D küresel oidlerin oluşumunun büyük ölçüde kanser hücresi line bağımlı olmasıdır. Küresel oluşum protokolümüz, farklı kanser hücresi hatları nın istihdam ı sayılsa, fibroblastlar ve kanser hücreleri arasındaki oranın optimizasyonunu gerektirebilir. Biz 3D spheroids oluşumu için bir insan melanom hücre ve fare fibroblast hücre likültür modeli kullanılan unutulmamalıdır, çünkü çok daha kolay fare fibroblastlar gof veya LOF hücreleri oluşturmak için bir molekül ünfheroid oluşumunu düzenleyen bir molekül veya sinyal yolu rolü çalışması için. İnsan melanom hücrelerinin ve fare fibroblastlarının küresel oidiler oluşturma yeteneği, hücre-hücre iletişimi için gerekli olan moleküllerin türler arası çalıştığını gösterir. Yakın zamanda insan melanom hücreleri ile insan fibroblastlar coculture test ettik ve insan fibroblastlar da 3D spheroidler oluşturmak için insan melanom hücreleri düzenleyebilir bulundu.
Çok hücreli 3D küresel modelde insan metastatik melanom hücreleri Olan C8161'i çalıştırdık. Biz de diğer insan melanom hücreleri test, örneğin, 1205Lu32, Hangi BRAFV600E mutasyonu taşır, ve MeWo, CDK4/Kit yüksek düzeyde ifade (ATCC HTB-65), ve onlar da coculture 3D küresel oluşturmak mümkün bulundu. Bu tümör hücreleri tarafından 3D spheroidlerin oluşumu onkojenik mutasyonların türlerinden bağımsız olduğunu gösterir. Melanom dışı tümör hücrelerinin diğer tipfibroblastlar ile 3D spheroidler oluşturma yeteneğine sahip olup olmadığını test etmemiş olsak da, bulgularımız 3D spheroidoluşumunun melanom hücre hattıyla sınırlı olmadığını ve belirli bir kanser hücresi hattına bağlı olmadığını göstermektedir.
3D küresel modelimizin pratik uygulamalarından iki örnek gösterdik. Bir örnek kanser kök / başlatan hücre fenotip ve 3D küresel oluşumu düzenleyen hücre içi Çentik sinyal yolu aktivitesini açıklamak oldu. Biz CAF hücre içi Çentik sinyal yolu bu 3D küresel modeli kullanarak kanser kök / başlatan hücrelerin fenotip kontrol moleküler bir anahtar olduğunu gösterdi. Bulgularımız sadece kanser kök / başlatan hücreleri ve kanser heterojenitesi stromal düzenleme altında yatan moleküler bir mekanizma ortaya çıkarmak değil, aynı zamanda CAF Notch yolu melanom terapötikleri için kritik bir hedef olduğunu vurgulamak. Bu örnek, 3D küresel modelimizin kanser hücresi-stromal fibroblast etkileşimlerinin mekanizmalarını incelemek ve potansiyel tedavi hedeflerini belirlemek için çok yararlı olduğunu göstermektedir. Başka bir örnek, CAF varlığında kanser kök / başlatan hücrelerin ilaç yanıtı test etmek oldu. Bu iyi kanser hücrelerinin ilaç yanıtı bilinmektedir, kanser kök de dahil olmak üzere / başlatan hücreler, varlığı ve CAF yokluğunda değişir. Bu in vitro sistemde CAF varlığı bu modeli daha klinik olarak ilgili ve oluşturulan test sonuçları daha güvenilir hale getirir. Ayrıca, bizim 3D küresel sistem çok yönlüdür. Çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Örneğin, ilaca dirençli kanser hücreleri bu 3D modelde istihdam edilirse, ilaç direnci ve belki de tümör nüks adresine değiştirilebilir. Aynı zamanda öncelikle kanser tedavisi için CAF hedef test veya ekran ilaçlar için değiştirilebilir. CAF son zamanlarda umut verici terapötik hedefler haline gelmiştir. CAF hedeflemenin avantajları vardır. Birincisi, anormal tümör hücreleri ile karşılaştırıldığında (genellikle genetik değişiklikler ile) ve akıllı (kolayca kemoterapi direnci kazanmak- ve radyoterapiler), tümör dokusunda CAF normal hücreler ve genetik olarak daha istikrarlı, bu yüzden tedavilere direnç geliştirmek için daha az olasıdır. İkinci olarak, CAF'ı hedeflemek tümör hücrelerindeki onkojenik mutasyonların türüne bağlı değildir. Üçüncü olarak, CAF hedefleme fibroblastlar bağımlı anti-tümör, anti-anjiyogenez ve / veya modüle kanser bağışıklık yanıtı yoluyla birden fazla isabet etkileri elde edinebilir. Bizim 3D küresel model kanser tedavi stratejileri çeşitli setleri keşfi için güçlü bir araçtır.

Solid tümörler neoplastik hücrelerden oluşan kompleks dokuları ve çok çeşitli stromal hücreleri temsil eder1,2,3,4. Stromal fibroblastlar veya kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF), solid tümörlerin çoğunda belirgin stromal hücre popülasyonlarından biridir. Onlar kritik tümör büyümesi, köklük, metastaz, anjiyogenez ve ilaç direnci büyüme faktörleri, sitokinler / chemokines, ECM sentezi ve remodeling enzimlerin (örneğin, kollajen, fibronektin ve matris metalloproteases), eksizomların serbest ve doğrudan heterotipik hücre-hücre etkileşimi5,6,7,8 , 10 ,10üretimi yoluyla ilaç direnci düzenleyen yer almaktadır . CAF ayrıca primer lezyonda heterojen tümör hücre popülasyonlarından tümör klonların bir alt kümesini önceden seçerek ve bu seçilmiş klonların metastaz için metastaz için mikroortamı seçilen klonların yeniden kolonileştirilmesi için en uygun olan belirli bir uzak organa göre geliştirilmesini teşvik ederek kanser organına özgü metastazın belirlenmesinde de rol alırlar12. Ayrıca, fibroblastlar ve onların salgılanan çözünür faktörler ve ECM tümör anjiyogenez modülasyonu katılmak13,14, anti-tümör immün yanıt15, ve hatta ilaç direnci ve tümör nüks dahil16,17.
In vitro 3D tümör küresel modeller geliştirilmiş ve in vitro kanser hücre kültürleri ve in vivo tümör modelleri arasında bir ara model olarak kanser araştırmalarında kullanılan18,19,20,21. 3D tümör küresel modelleri kanser kök hücre araştırmapopülerlik kazanmıştır, preklinik kanser araştırma, ve ilaç tarama bu modeller geleneksel 2D monolayers yok gerçek tümörlerin bazı önemli özellikleri çoğaltmak çünkü22. Mevcut birçok 3D tümör küresel modeli sadece tümör hücrelerinden oluşur ve tümör stromal hücrelerinin katılımı ndan yoksundur. Bu genellikle tümör sferoidlerinin yetersiz ECM birikimine ve heterotimopik hücre-hücre etkileşimlerinin olmamasına neden olabilir. Sadece kanser hücreleri ve homotipik hücre-hücre adezyonu tarafından oluşturulan konvansiyonel 3D spheroidler tümör dokularının in vivo durumlarını kısmen taklit edebilir. Bu sınırlamaların bazılarını aşmak için, araştırmacılar 3D cocultures stromal hücrelerin birden fazla tip içeren önerdi ve çeşitli heterotip 3D tümör sferoid modelleri geliştirdi23,24,25,26,27. Buna ek olarak, araştırmacılar doğal hidrojeller veya polietilen glikol, poli (laktit- co-glikolit) vepoli (N-izopropylarilamid gibi sentetik polimerler de dahil olmak üzere eksojen 3D matrisler istihdam var, tek hücreli ve çok hücreli küresel küresel modelleri gömmek için, hücre destekleyici bir ortam yaratmak ve hücre-matris etkileşimleri yeniden üreten28,29, bu nedenle bu sistemleri daha biyolojik300biyolojik yapma . Ancak, 3D kokültürlerde endotel hücreleri gibi bazı stromal hücrelerin birleştirilmesi, bir in vitro sistem için ek karmaşıklık getiriyor ve zor iki hücre tipi arasında heterotipik hücre-hücre etkileşimleri çalışma yapar, kanser hücre-fibroblast etkileşimleri gibi. Ayrıca, gerçek dokularda endotel hücreleri her zaman doğrudan kanser hücreleri ve diğer stromal hücreleri ile etkileşim yok çünkü doğrudan kanser hücreleri ve diğer stromal hücreleri ile etkileşim endotel hücrelerinin önlenmesi kılcal damarlar dışında sarılmış bir bodrum zarı tabakası vardır. Bu 3D küresel modellerde, dahil endotel hücreleri aslında kan damarları oluşturmak değil, henüz kanser hücreleri ve diğer stromal hücreleri ile doğrudan etkileşim, nadiren in vivo oluşur bir şey. Benzer şekilde, bazı 3D küresel modellerde kullanılan ekzojen matrisler yapı ve kompozisyon açısından gerçek tümör dokularında ECM ile aynı değildir. Tüm bu yapay koşullar yanıltıcı verilere neden olabilir.
Yakın zamanda tümör hücreleri ve CAF oluşan yeni bir multisellüler 3D küresel model oluşturduk. Modelimizde 3Boyutlu tümör spheroidlerinin oluşumu tamamen CAF ile belirlenir. CAF indüklemek ve tümör kök / başlatan hücrelerin fenotip düzenler. CAF tarafından üretilen ECM doğaldır ve desmoplastik yapının in vivo tümör mikroortamını daha iyi taklit etmesini sağlar. Bu yeni 3D modeli kanser ilaç tarama için yararlı bir araç olabilir ve tümör-stroma etkileşimi incelemek için benzersiz bir platform sunuyor, nasıl CAF kanser kök düzenleyen açıklık / hücreleri başlatma, ve kanser ilaç duyarlılığı ve direnci stromal etkileşimlerin katılımını keşfetmek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-253-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1.5 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-2674</td>
			<td>500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>Dako</td>
			<td>x0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase Grade II</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>165859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VMR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Premium Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free for downloading, no license needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom 2016A</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom System</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium (Leibovitz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 153 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7403-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti &#945;-SMA (smooth muscle actin), monoclone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olymupus CellSens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem Chemicals</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002- CI</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5%</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-035-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel stromal fibroblast-modulated 3d tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery

Tümör-stroma etkileşimleri kanser inprogresyonunda önemli bir rol oynar. Üç boyutlu (3D) tümör sferoid modelleri kanser sapı/başlatan hücreler, klinik öncesi kanser araştırmaları ve ilaç taraması çalışmalarında en yaygın olarak kullanılan in vitro modeldir. 3D küresel modeller konvansiyonel tümör hücre kültüründen üstündür ve gerçek solid tümörlerin bazı önemli karakterlerini üretirler. Ancak, konvansiyonel 3D tümör spheroidler tümör hücrelerinin sadece oluşur. Onlar tümör stromal hücrelerinin katılımı eksikliği ve yetersiz ekstrasellüler matriks var (ECM) birikimi, böylece sadece kısmen tümör dokularının in vivo koşulları taklit. İn vivo heterojen tümör mikroçevresini ve doğal desmoplaziyi daha iyi taklit eden tümör hücreleri ve stromal fibroblastlardan oluşan yeni bir multihücreli 3D küresel model oluşturduk. Spekofoidlerin oluşumu kesinlikle tümör stromal fibroblastlar tarafından düzenlenir ve stromal fibroblastlarda bazı önemli hücre içi sinyal yollarının aktivitesi ile belirlenir (örneğin, Çentik sinyalizasyon). Bu makalede, tümör hücreleri-stromal fibroblastların eşkültür teknikleri, hücre-hücre etkileşimlerini görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüleme ve küresel lerin 3 Boyutlu mimari özelliklerini görüntülemek için konfokal mikroskopi saklı dır. Ayrıca bu 3D küresel modelin pratik uygulama iki örnek göstermektedir. Bu yeni çok hücreli 3D küresel model tümör-stroma etkileşimini incelemek için yararlı bir platform sunuyor, stromal fibroblastlar kanser kök düzenleyen nasıl açıklığa kavuşturan / başlatAn hücreleri, tümör ilerlemesi ve agresiflik belirlemek, ve kanser ilaç duyarlılığı ve direnci stromal reaksiyon katılımı keşfetmek. Bu platform aynı zamanda ilaç keşfi için uygun bir in vitro modeli olabilir.

İn vivo tümör mikroçevresini taklit eden in vitro heterotipik hücre kokültür sistemi ile 3Boyutlu küresel ler üretmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Fibroblastlar fare derisi fibroblastlarından türetilmiştir. Deri fibroblastları yukarıda açıklandığı şekilde üretildi ve α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ hücreleri olarak tanımlandı. İnsan metastatik melanom hücreleri (C8161) W489 ortamda32olarak tanımlanmış olarak kültürlü edildi. Fibroblastları tümör hücrelerinden görselleştirmek ve ayırt etmek için fibroblastlar ve melanom hücreleri gfp/lentivirus ve DsRed/lentivirus ile pretransdüktif, sırasıyla34,36, hücre kokültürden önce.
Şekil 1, melanom hücreleri ve fibroblastların bir arada kurulmasıyla oluşan çok hücreli 3D küreseloidlerin bir örneğini göstermektedir. Fibroblastların yokluğunda kültürlenen melanom hücreleri tipik 3D sferoidler oluşturmadı, ancak bazı melanom hücreleri genişletilmiş kültürile 2D kümeler/agregalar oluştururlar. Küresellerin ortalama boyutu ~5−7 gün çapı yaklaşık 170-360 μm (ortalama = 275, SD = 37) idi. Zaman atlamalı görüntüleme kullanarak fibroblastlar ve tümör hücrelerinin birlikte kültürde etkileştiğini gözlemledik ve Video 1'degösterildiği gibi yaklaşık 36 saat eşkültürde 3Boyutlu spheroidler oluşturmaya başladık. Hızlandırılmış görüntüleme hücre-hücre etkileşiminin dinamik sürecini ve küresel oluşumun başlangıç evresini ~4-52 h'de kaydetti. 3D küresel formasyonun zirvesi ~5−7 civarında meydana geldi. Oluşan 3D küresel oidler fibroblastlar ve melanom hücrelerinden oluşur, çoğunluğu (%~80) tümör hücreleriydi. Video 2, tek kültürde ~4-52 h'den başlayarak hücre kümesi/agregaoluşumunda tek kültürlü melanom hücrelerinin (DsRed+/C8161) dinamik sürecini gösterir. 2B kümelerin/toplamların oluşumu ~7-10 gün civarında doruğa ulaştı. Video 3 ve Video 4, konfokal mikroskopi ile görselleştirilen 3Boyutlu küresel oidoid ve 2D tümör hücre kümesinin yapılarını göstermektedir. 3D spheroid ve 2D tümör hücre kümeleri hücre kokültürünün 7. Video 5 3D spheroids kültür orta ve mobil askıya olduğunu gösterir, Video 6 2D tümör hücre kümesi kültür plakası bağlı ve hareketsiz olduğunu gösterir. Orta süspansiyon 2B kümeleri onları ayıran 3D spheroids bir özelliğidir. Hücre kültürü çanak veya iyi orta ya bırakarak ya da yavaşça kültür ortamı pipetting rahatsız olduğunda, askıya 3D küreseller hareket, 2D hücre kümeleri ise hareketsiz. Sadece birkaç ölü hücre hareketlidir.
Şekil 2A, tümör-stroma etkileşimlerini incelemek ve CAF'daki hücre içi Notch1 sinyal yolu aktivitesinin kanser kökünü/başlangıç hücrelerini ve küresel oluşumu nasıl düzenlediğini açıklamak için benzersiz bir platform olarak hizmet veren bu 3D modelin bir örneğini göstermektedir. İki çift fibroblast (Fb) Gain-Of-Fonksiyon Çentik 1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-deriden izole; ROSALSL-N1IC+/+fareler karşı muadili kontrolü (GOFctrl : FSP1. Kre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) fareler ve Fonksiyon Kaybı Çentik1 (LOFÇentik1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+fareler karşı muadili kontrolü (LOFctrl : FSP1. Kre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+)fareleri sırasıyla 35. Tüm fibroblastlar GFP/lentivirus ile transene edildi ve DsRed/lentivirus ile pretransdüktif C8161 melanom hücreleri ile birlikte işlendi. Hızlandırılmış görüntüleme, Fb-GOFNotch1'in C8161 melanom hücrelerinin hücre eşkültürünün ilk ~4-52 h'si sırasında Fb-GOFctrl ile karşılaştırıldığında 3Boyutlu spheroidler oluşturmasını engellediğini göstermektedir. Buna karşılık, Fb-LOFNotch1 Fb-LOFctrlile karşılaştırıldığında C8161 melanom hücreleri tarafından 3D küreseloidlerin oluşumunu teşvik . Şekil 2B, üst, çeşitli Çentik yol faaliyetleri yürüten farklı fibroblastlar ile hücre coculture gün 7 oluşan 3D sferoidlerin temsili görüntüleri gösterir. Şekil 2B, alt, çeşitli Çentik yol faaliyetleri taşıyan farklı fibroblastlar ile hücre kokültürünün 7.
Şekil 3 kanser kök / başlatan hücrelerin ilaç yanıtı test etmek için kullanılan bu 3D modelin bir örnek gösterir. Kanser kök / başlatan hücreler ilaç direnci ve kanser nüks sorumlu olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, Bu 3D modeli kullanarak ilaç yanıtı değerlendirilmesi daha iyi kanser tedavisi için potansiyel bir ilacın klinik etkinliğini ortaya çıkarabilir. C8161 melanom hücreleri hücre büyümesi ve invazyonu için aktif MAPK sinyaline dayanır. Ayrıca yüksek düzeyde CDK4/Kit ifade ederler, ancak BRAF mutasyonu taşımaz. Bu 3D modeli kullanarak MAPK inhibitörüne doğru kanser kök / başlatan hücrelerin ilaç yanıtı test etmek için, 24 kuyu plakaları C8161 melanom hücreleri ve fibroblastlar cokültürd. PD0325901 (bkz. Malzeme Tablosu),bir MAPK inhibitörü, 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM ve 25 nM'den oluşan bir dizi konsantrasyonda seri seyreltme ile hazırlanmıştır. PD0325901 hücre karışımları kaplandığında hücre kokültürlerine eklendi. Tedavi edilmeyen kokültür hücreleri kontrol olarak kullanılmıştır. Hücre kokültürlerinin farklı ilaç konsantrasyonları altında küresel şekillendirme yeteneğini değerlendirdik ve tedavi edilmeyen kontrolle karşılaştırdık. Şekil 3A, hücre kokuşukkültürünün 5. Şekil 3B, hücre eşkültürünün 5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig01.jpg"> Şekil 1: 3D küresel ve 2B kümelerin oluşumu. (A) İnsan C8161 melanom hücreleri ve fare derisi fibroblastlarının eşkültürlülük tarafından oluşturulan 3D spheroidlerin temsili görüntüsü. 3D spheroidler melanom hücreleri ve fibroblastlar coculture gün 7 fotoğraflandı. Küresellerin ortalama boyutları ~170-360 μm çapında (ortalama = 275, SD = 37) gün ~5−7 idi. Ortalama küresel sferoid sayısı düşük güç alanı başına 18-26 (20.5 ± 3.6) idi (LPF x4). (B) C8161 melanom hücrelerinin tek kültürü ile oluşan 2B tümör hücre kümelerinin temsili görüntüsü. 2D melanom hücre kümeleri melanom hücrelerinin tek kültür gün 7 fotoğraflandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig1alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig02.jpg"> Şekil 2: 3D küresel model kullanılarak kanser kök /başlatan hücrelerin düzenlenmesinde CAF hücre içi Notch1 sinyal yolu aktivitesinin rolünün açıklanma. (A) CAF'da hücre içi Çentik1 sinyal yolu aktivitesi hücre kokültüründe melanom hücreleri tarafından spheroidlerin oluşumunu belirlemiştir. Hızlandırılmış video Fb-GOFNotch1 C8161 melanom hücreleri tarafından 3D spheroidlerin oluşumunu durdurdu gösterir, Fb-LOFNotch1 hücre coculture ilk sırasında C8161 melanom hücreleri tarafından daha fazla 3D spheroidoluşumunu teşvik ederken. (B) Üst: Hücre kokuşuklarının 7. Alt: Hücre kokuşuklarının 7. İki kuyruklu öğrencinin t-testi istatistiksel analiz için kullanıldı. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig2alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig03.jpg"> Şekil 3: 3D küresel model kullanılarak kanser sapı/başlatan hücrelerin ilaç yanıtının değerlendirilmesi. (A) Farklı ilaç konsantrasyonları altında hücre kokültürünün 5. (B) Hücre eşkültürünün 5. Nicel veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig3alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Screenshot 1" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid01.jpg"> Video 1: Hücre eşkültürünün erken evresinde 3Boyutlu küresel lerin oluşumunun dinamik süreci. Hızlandırılmış görüntüleme, fibroblastlar ve tümör hücreleri arasındaki dinamik hücre etkileşimlerini gösterir ve hücre eşkültürünün ilk ~4-52 h'sinde 3Boyutlu küreseloidlerin oluşumunu gösterir. Hücreler, eşkültürün başlamasından sonra 48 saat civarında 3Boyutlu küresel ler oluşturmaya başladılar. 3D küresel formasyonun zirvesi ~5−7 gününde meydana geldi (burada görüntülenmedi). 3D küreseloidler fibroblastlar ve melanom hücrelerinden oluşur, çoğunluğu (%~80) tümör hücreleriydi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_1.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Screenshot 2" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid02.jpg"> Video 2: Hücre kokültürünün erken evresinde 2B kümelerin oluşumunun dinamik süreci. Hızlandırılmış görüntüleme, C8161melanom hücrelerinin tek bir kültürde oluşturduğu 2B kümelerin dinamik sürecini gösterir. 2B kümelerin oluşumu ~ 7-10 gün civarında meydana geldi. Hızlandırılmış görüntüleme, DsRed+/C8161 melanom hücrelerinin tek kültüründe ~4-52 h dönemini kaydeder. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_2.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Screenshot 3" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid03.jpg"> Video 3: Konfokal mikroskopi ile görselleştirilen 3Boyutlu bir küreseloidin mimarisi ve rotasyonu. Mimari ve 3D küresel rotasyon. Hücre kokültürde 7. Tbmm alanı 10x hedefi altında belirlendi. Talan 1 μm z-adımda küresel oidin en altından yukarısına doğru başlar. 3D küresel rotasyon filmi Fiji yazılımı kullanılarak oluşturuldu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_3.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Screenshot 4" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid04.jpg"> Video 4: Konfokal mikroskopi ile görselleştirilen 2D tümör hücre kümesinin mimarisi ve rotasyonu. 2B kümesinin mimarisi ve dönüşü. Hücre kümelerinin konfokal görüntüleri melanom hücre tek kültür gün 7 alınmıştır. Tbmm alanı 10x hedefi altında belirlendi. Talan 1 μm z-adımda küresel oidin en altından yukarısına doğru başlar. 2B küme döndürme filmi Fiji yazılımı kullanılarak oluşturuldu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_4.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Screenshot 5" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid05.jpg"> Video 5: 3D küresellerin hareketi. 3D küresel ler kültür ortamında askıya alındı ve kültür çanak / iyi uymadı. Hücre kültüründe hala orta iyi nazik pipetleme tarafından rahatsız edildi, askıya 3D spheroids taşındı. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_5.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Screenshot 6" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid06.jpg"> Video 6: 2B tümör hücre kümelerinin kararlılığı. 2D tümör hücre kümesi kültür plakasına sabitlenmiş ve kültür ortamının bozulmasına rağmen hareketsizdir. Birkaç ölü hücre hareket halindeydi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_6.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery at JoVE.com

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tümör hücreleri ve stromal fibroblastların heterotipik etkileşimine dayanan üç boyutlu yeni bir küresel model oluşturulmuştur. Burada, spheroidlerin oluşumunu görselleştirmek için tümör hücreleri ve stromal fibroblastlar, hızlandırılmış görüntüleme ve konfokal mikroskopi ortak kültürünü satıyoruz. Bu üç boyutlu model tümör-stroma etkileşimleri ve test kanser terapötik çalışma için ilgili bir platform sunuyor.

Tümör-Stroma Etkileşimi ve İlaç Keşfini İncelemek İçin Yeni Bir Stromal Fibroblast-Modüle 3D Tümör Küresel Modeli

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Biz kanser-stroma etkileşimleri çalışma ve kanser terapötik test etmek için bir platform sunan yeni bir 3D spheroids modeli geliştirdik. Benim bakış açıma göre, bu 3D sistem daha iyi gerçek tümör koşulları taklit etmek için bir stroma fibroblast kanser hücrelerini birleştirir ve bu nedenle, ilaç keşif için çok güçlü bir araç olabilir. Buna ek olarak, bu model Melanom çalışma ile sınırlı değildir.Bu kanserlerin diğer türleri araştırmak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Dr. Hongwei Shao, laboratuvarımdan kıdemli bir bilim adamı. Insan melanom hücre kültürü için, konvansiyonel yapışık hücre kültürü koşulları altında hücreleri atmak ve tam W489 orta 37 santigrat derecede 5% karbondioksit.Hücreler %90 birleştiğinde, hücreleri bir ila beş oranında bölün. Fare derisi fibroblast kültürü için, numuneleri toplamadan önce PBS'de hasat edilen doku peletlerini yıkayın ve dMEM yüzde 10 fetal sığır serumu ve hücre kültürü kuluçka makinesinde yüzde bir penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir. Hücreleri yüzde 90'lık bir araya geldiklerinde bire iki oranında bölün.Kokültürleri kurmadan önce, tohum fibroblastları 100 milimetrelik bir tabağa öyle bir konsantrasyonla bağlanır ki hücre birleşmesi ertesi gün yaklaşık yüzde 60'a ulaşır. Ertesi sabah, normal kültür orta polibren başına dört mikrogram ile desteklenen stok seyreltilmiş lentivirus gfp bir-üç-bir-beş konsantrasyonu ile supernatant değiştirin. Taze kültür ortamı ile supernatant değiştirmeden önce altı saat boyunca hücre kültürü kuluçka içine hücreleri yerleştirin.İki gün sonra, floresan mikroskobundaki hücrelerden gelen GFP sinyalini gözlemleyin. Her iki hücre kültürü de stfecably transfected olduğunda, centuvigation tarafından tek hücresüspansiyonları toplamak için 0.25 tripsin-EDTA her iki hücre kültürleri ayırın. Tekrar iki kez 10 dördüncü hücrelerde coculture orta konsantrasyon mililitre başına hücreleri askıya ve bire bir oranında melanom hücreleri ve fibroblastlar karıştırın.Daha sonra her bir kuyuiçin iki mililitre hücre görün 24 kuyu plakave her durum için triplicate ve hücrelerin plaka altına takılması için dört saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesinde plaka yerleştirin. Melanom hücre yalnız kültür 2D hücre küme oluşumunu değerlendirmek için, iki kez bakın 10 bir 24 iyi plaka ve kültür hücre kültür kuluçka yedi ila 10 gün boyunca her kuyuiçine dördüncü melanom hücreleri. Daha sonra hücreleri standart floresan mikroskopi protokollerine göre ters floresan mikroskopta fotoğraflayın.Zaman atlamalı görüntüleme sistemi kapalıysa, görüntülemeden en az bir saat önce açın. Sistem hazır olduğunda, kültür plakasını dikkatlice mikroskop aşamasına aktarın ve kuvöze kaydırın ve kapıyı güvenli bir şekilde kilitleyin. Zaman atlamalı görüntüleme sisteminin yazılımını açın ve plaka türünü ve üreticiyi seçmek için damar ekle'yi tıklatın, böylece mikroskop tarama alanını doğru bir şekilde bulabilir.10 kat objektif lens ve ilgi kuyuları seçin ve tarama alanı için parametreleri ayarlayın, taramalar ve bir başlangıç ve bitiş süresi arasındaki aralık lı zaman. Sonra 4 ila 52 saat arasında zaman atlamalı görüntüleme kaydedin. Görüntü kaydının sonunda, verileri almak ve toplanan videoları veya görüntü kümelerini dışa aktarmak için zaman atlamalı görüntüleme sistemi yazılımını kullanın.Kokültürlerin konfokal mikroskopi görüntülemesi için plakayı ters floresan mikroskobun sahnesine yerleştirin ve kırmızı ve yeşil lazer ışınlarını seçin. Beş veya 10 kat objektif altında hücreleri gözlemleyin ve tarama başlatmak için küresel seçin. Bir mikron z-adım kullanarak, küresel dibine kadar tazyik.Daha sonra daha fazla döndürülebilir ve bir 3D film olarak kaydedilebilir bir 3D görüntü yeniden oluşturmak için uygun görüntü işleme yazılımı kullanarak verileri işlemek. Burada, cokültüre melanom hücreleri ve fibroblastlar tarafından oluşturulan çok hücreli 3D spheroidlerin görüntüleri gösterilmiştir. Fibroblastların yokluğunda kültürlenen melanom hücreleri tipik 3D spheroidler oluşturmaz, ancak bazı melanom hücreleri genişletilmiş kültüre sahip 2B kümeler oluştururlar.Zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak, fibroblastlar ve tümör hücreleri yaklaşık 36 saat tespüloidlerden başlayarak, kokültürde etkileşim gözlenebilir. Bu filmde, tek kültürlü melanom hücre agrega oluşumunun 4 ila 52 saatlik kültür oluşumunun dinamik süreci gözlemlenebilir. Burada, bir 3D küresel yapı kültür yedi gün sonra konfokal mikroskopi ile görülebilir, bu filmde ise, bir 2D hücre kümesi görselleştirilmiş olabilir.3D küreseloidler kültür orta asılı kalır ve mobil, 2D tümör hücre kümeleri kültür plakası eklemek eğilimindedir ve hareketsiz iken. Bu 3D modeli tümör-stroma etkileşimleri incelemek için benzersiz bir platform olarak hizmet vermektedir. Örneğin, nasıl hücreler arası Notch1 sinyal yolu aktivitesi ve kanser ilişkili fibroblastlar kanser kök ve hücre ve küresel oluşumu nu başlatan düzenleyen açıklamak için.Buna ek olarak, Bu model kanser kök ilaç yanıtlarını test etmek ve hücreleri başlatan için kullanılabilir. Bu yöntem basit ve yalındır olmasına rağmen, doğru hücre yoğunluğu nu ve hücre oranını kullanmaya ve gösterildiği gibi uygun kültür plakalarını kullanmaya özen gösterin. Bu 3D modeli aynı zamanda kanser kök hücrelerinin fenotiplerini belirlemek için önemli hücre içi sinyal yolu aktivitesini yatıştırmak ve kanser kök hücrelerinin son derece hassas olduğu küçük molekül bileşiklerinin taranması için de uygulanabilir.

Tümör-Stroma Etkileşimi ve İlaç Keşfini İncelemek İçin Yeni Bir Stromal Fibroblast-Modüle 3D Tümör Küresel Modeli

Abstract