Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках

Ключевые клеточные события, такие как трансдукция сигнала и мембранный оборот, зависят от правильного расположения белка в сотовых отсеках. Понимание точной субклеточной локализации белков, таким образом, имеет важное значение для ответа на многие биологические вопросы. Поискнадежной этикетки для определения локализации белка в сочетании с адекватной клеточной консервацией и окрашиванием исторически был сложным. Недавние достижения в области визуализации электронной микроскопии (EM) привели к разработке многих методов и стратегий для увеличения клеточной консервации и маркировки целевых белков. Относительно новый генетический тег на основе пероксидаза, APEX2, является перспективным лидером в области клонируемых ЭМ-активных тегов. Подготовка образцов для передачи электронной микроскопии (TEM) также продвинулась в последние годы с появлением криофиксации путем замораживания высокого давления (HPF) и низкотемпературного обезвоживания и окрашивания через замену замораживания (FS). HPF и FS обеспечивают превосходное сохранение клеточной ультраструктуры для tEM-изображений, уступая только прямой крио-изображению образцов стекловидного тела. Здесь мы представляем протокол для метода cryoAPEX, который сочетает в себе использование тега APEX2 с HPF и FS. В этом протоколе, белок интерес маркируется APEX2, а затем химической фиксации и реакции пероксидазы. Вместо традиционного окрашивания и обезвоживания алкоголя при комнатной температуре, образец крификируется и подвергается обезвоживанию и окрашиванию при низкой температуре через FS. Используя cryoAPEX, не только может быть идентифицирован интересуемый белок в субклеточных отсеках, но и дополнительная информация может быть решена в отношении его топологии в структурно сохранившейся мембране. Мы показываем, что этот метод может обеспечить достаточно высокое разрешение для расшифровки моделей распределения белка в просвете органеллы, а также различать разобщенность белка в пределах одной органеллы в непосредственной близости от других немаркированных органелл. Кроме того, cryoAPEX является процедурно простым и поддается клеткам, выращенным в культуре тканей. Это не более технически сложной задачей, чем типичные методы криофиксации и замораживания замены. CryoAPEX широко применим для TEM-анализа любого мембранного белка, который может быть генетически помечен.