עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות (K01DK114390), מלומד מחקר מענקים מתוך האגודה האמריקנית לסרטן (RSG-18-050-01-NEC), פיילוט מחקר הפרויקט גרנט מאוניברסיטת ניו מקסיקו בריאות הסביבה חתימה תוכנית הסופרקרן (P42 ES025589), משאבים משותפים פיילוט הפרויקט ותוכנית המחקר תמיכה פיילוט הפרוייקט של UNM מקיף סרטן המרכז (P30CA118100) , ואת פרס החוקר החדש מקרנות מחקר בריאות ייעודי באוניברסיטת ניו מקסיקו בית הספר לרפואה.

1. זריעת תאים
<ol><li>זרע 2 x 105 HCT116 תאים סרטניים המעי הגס לכל טוב בצלחת 24-באר ולשמור על התאים בינונית שונה של הנשר של דולבקה (dmem) לילה ב 37 ° c.</li>
	<li>החלף את בינונית התרבות עם או בלי 100 μM ברזל גופרתי (FS) או 10 μM דוקסורוביצין (חמצון) המכיל בינונית ו-מודטה עבור 24 שעות.</li>
</ol>2. הכנת התמיסה...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

הפרוטוקול הניסיוני המתואר כאן הוא בקלות לעבור למדוד הכולל של הסלולר ROS. השלבים הקריטיים כוללים הפיכת פתרון DCFH-DA טרי והימנעות מחשיפה לאור, מזעור הפרעה למצב התא וכביסה נרחבת של PBS לפני נטילת תמונות. להכנת פתרון עבודה DCFH-DA, פתרון המניה צריך להיות מתווסף D, מחומם מראש לפני הוספת לתוך 24 צלחת הבאר. ...

שלושה מינים החמצן תגובתי העיקריים (ROS) המיוצר על ידי חילוף החומרים הסלולריים כי הם של משמעות פיזיולוגית הם סופראוקסיד anion, רדיקלי הידרוקסיל, ותחמוצת מימן1. בריכוזים נמוכים, הם משתתפים בתהליכי תאים פיזיולוגיים, אבל בריכוזים גבוהים יש להם השפעות שליליות על תא איתות מסלולים1. הגוף שלנו פיתח מערכות נוגדי חמצון, אשר יעילים נגד ROS מוגזמת. עם זאת, לחץ חמצוני יכול להתרחש כאשר רוס להציף את היכולת הרעלים של הגוף שלנו, אשר תורמת לתנאים פתולוגיים רבים, כולל דלקת, סרטן, ומחלות ניווניות2,3,4. מטרת שיטה זו היא לקבוע הסלולר הכולל בתאי חסיד באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA) כתמים. הרציונל הוא כי חמצון של DCFH-DA כדי 2 ' -7 ' dichlorofluorescein (DCF) כבר נעשה שימוש נרחב לאיתור ROS סה כולל רדיקלים הידרוקסיל (• או) חנקן דו חמצני (• לא2). מכונאי, DCFH-DA הוא נלקח על ידי תאים שבהם הסלולר מוחק העלים מקבוצות מרחלקסיל, וכתוצאה מכך DCFH. חמצון של DCFH על ידי ROS ממיר את המולקולה DCF, אשר פולט ירוק פלואורסצנטית באורך הגל של 485 ננומטר ו-אורך הגל של 530 ננומטר. לעומת גילוי של ניאון עם הזרימה cy, ושיטות חלופיות אחרות5, היתרונות של שיטה זו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית וקורא צלחת הם שהוא מייצר בבירור תמונות פלורסנט לעין, והוא קל לבצע, יעיל וחסכוני. שיטה זו היתה בשימוש נרחב כדי לזהות ROS סלולריים לחקר מצבים שונים6,7,8. פרוטוקול זה משמש לזיהוי הכולל של ROS בתאי חסיד. שימוש בשיטה זו כדי לזהות ROS בתאים ההשעיה עשוי להזדקק לשינויים מסוימים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

לחץ חמצוני הוא אירוע חשוב תחת התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים. במחקר זה, אנו מדגימים כיצד לכמת את המתח חמצוני על ידי מדידת מינים הכולל חמצן תגובתי (רוס) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA) כתמים בתוך סרטן המעי הגס שורות התאים כדוגמה. פרוטוקול זה מתאר שלבים מפורטים כולל הכנה של פתרון DCFH-DA, דגירה של תאים עם פתרון DCFH-DA, ומדידה של עוצמה מנורמלת. DCFH-DA כתמים היא דרך פשוטה וחסכונית לזהות ROS בתאים. זה יכול לשמש כדי למדוד את הדור ROS לאחר טיפול כימי או שינויים גנטיים. לכן, הוא שימושי לקביעת לחץ חמצוני תאי על לחץ הסביבה, מתן רמזים למחקרים מכניסטיים.

HCT116 תאים סרטניים המעי הגס טופלו עם 100 μM FS או 10 החמצון μM כדי לגרום לחץ חמצוני7. כפי שמוצג באיור 1, הזריחה הירוקה הוגדלה באופן דרמטי על-ידי סה כ והחמצון כצפוי. כדי לכמת את השינוי באינטנסיביות היחסית, התאים היו לאחר לקיחת תמונות מנורמל עם ריכוזי חלבון. עוצמת הקרינה ה...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.

גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

שיטה זו יכולה לשמש לניתוח מיני חמצן תגובתי תאי בתאים חסידיים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בלבד, ולכומת את עוצמת מיני החמצן תגובתי עם קורא לוחיות פלואורסצנטיות. פרוטוקול זה פשוט, יעיל וחסכוני. התחל על ידי זריעה פעמיים 10 לתאי סרטן המעי הגס HCT116 החמישי ב- DMEM לתוך כל באר של צלחת 24 באר.דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, החלף את מדיום התרבות ב-100 מיקרומולאר ברזלי גופרתי, או 10 מדיום המכיל טוקסורוביצין מיקרומולארי, ודגירה של הצלחת למשך 24 שעות נוספות. הכן את פתרון DCFH-DA על-ידי המסת 4.85 מיליגרם של DCFH-DA במיליליטר אחד של DMSO כדי ליצור פתרון מלאי של 10 מילימולרים.ממש לפני הוספתו ל בארות, לדלל את המניה עם DMEM מחומם מראש כדי להפוך פתרון עבודה 10 micromolar, ו מערבולת זה במשך 10 שניות. כדי להכתים את התאים, להסיר את המדיום המכיל סמים, ולשטוף אותם פעם אחת עם DMEM. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של פתרון עבודה DCFH-DA לתוך כל באר, ו דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר הדגירה, להסיר את DCFH-DA מן בארות, ולשטוף אותם פעמיים עם DMEM, ופעם אחת עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של PBS לכל באר. השתמש בתעלת החלבון הפלואורסצנטי הירוק במיקרוסקופ הפלואורסצנטי כדי לצלם תמונות מייצגות של התאים.לאחר מכן הסר את PBS, ולהוסיף 200 microliters של מאגר בדיקה radioimmunoprecipitation לכל באר. דגירה את הצלחת על קרח במשך חמש דקות, ולאסוף את lysates התא לתוך 1.5 צינורות מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות ב 21, 130 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.ואז להעביר 100 microliters של supernatant לצלחת שחורה 96 באר. השתמש בקורא מיקרופלסטיק באורך גל של 485 ננומטר, ואורך גל פליטה של 530 ננומטר, כדי למדוד את הפלואורסצנטיות בכל באר. לאחר מכן, למדוד את ריכוז החלבון עם בדיקה ברדפורד על ידי העברת microliter אחד של supernatant לצלחת ברורה 96 גם עם 100 microliters של פתרון בדיקה חלבון.השתמש בריכוזי החלבון כדי לנרמל את התעצמות הפלואורסצנטיות. HCT116 תאים סרטניים המעי הגס טופלו עם 100 מיקרומולאר ברזלי סולפט, או 10 דוקסורוביצין מיקרומולרי, כדי לגרום ללחץ חמצוני. כצפוי, פלואורסצנטיות ירוקה הוגדלה באופן דרמטי על ידי שני הטיפולים.כדי לכמת את השינויים בעוצמה היחסית, התאים היו lysed ו מנורמל עם ריכוזי חלבון. עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית הוגדלה באופן משמעותי על ידי ברזלי סולפט או טוקסורוביצין. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להפוך את פתרון DCFH-DA טרי ולהימנע מחשיפה לאור, כמו גם למזער את ההפרעה למצב התא, ולבצע שטיפה נרחבת של PBS ממש לפני צילום תמונה.בנוסף לגילוי של ROS הכולל על ידי פרוטוקול זה, במיוחד ROS כגון חמצן יכול להתבצע.

גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

Abstract