ويود المؤلفان أن يشكرا سيلين جانتي على مساعدتها في إنشاء الكريات الخلوية مع علاج MG-132 على النحو المبين في النتائج التمثيلية وإليز مومارتس على توفيرها لكريات الإشريكية القولونية المستخدمة في البروتوكول.

1. إعداد معيار الببتيد الثقيلة
<ol><li>اعتمادا على المورد وجودة الببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها ، فإن الببتيدات الثقيلة تحتاج إلى تخفيفها. استخدم هذا البروتوكول تسلسل الببتيد المبلغ عنها في الجدول 1، مع الأحماض الأمينية C-terminal المعدلة إلى ليسين(13C615N2-lysine) أو ?...

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+post-translational+modification+statistics:+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database.">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90 (2011).</li><li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells.">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+Destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code.">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies.">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li><li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain.">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li><li>Borr&#224;s, E., Sabid&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+targeted+proteomics?+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry.">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li><li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics.">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li><li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry.">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles.">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+(SRM)+Mass+Spectrometry.">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li></ol>

تحليل حالة كل مكان داخل البروتيوم هو ذات أهمية متزايدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. يجب أن يركز وصف حالة الانتشار في كل مكان للعينة ليس فقط على ملف البروتينات التي يتم نشرها في كل مكان ولكن أيضا على طوبولوجيا مثل هذا الانتشار. تقييم هذه الطوبولوجيا من قبل MS المستهدفة، كما هو موضح ه?...

التنظيم الوثيق لوظيفة البروتين والاستقرار له أهمية قصوى ، لأنها محركات رئيسية للسيطرة على علم الأحياء. يتم بناء وظيفة البروتين من عنصرين: تسلسله البوليبتيد الجوهري وأي تعديلات ما بعد النقل (PTMs). وقد تم تحديد مختلف PTMs الكيميائية بما في ذلك الجليكوزيليشن، الفوسفور، أسيتيل، والمثيلة1. في عام 1975، حدد غولدشتاين وآخرون2 بروتين صغير وأطلق عليه اسم يوبيكيتين بسبب طبيعته في كل مكان. تم العثور على يوبيكيتين أن تكون مهمة في تدهور البروتين3. ومع ذلك ، منذ ذلك الحين ثبت أن وظيفة كل مكان كجزيء إشارات تمتد إلى ما هو أبعد من تنظيم استقرار البروتين. وتشارك إشارة يوبيكيتين في مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية الأخرى, مثل استقرار البروتين, autophagy, خلية التحكم في دورة, والاتجار البروتين4.
في حين أن PTMs الأخرى ثنائية بشكل عام (أي يتم تعديل البروتين أو تركه غير معدل) لموقع معين ، يمكن أن يعدل ubiquitin بروتينا سواء كمونومر أو كسلسلة بوليمرية ، مع وجود كل مكان مرفق في حد ذاته في كل مكان. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتطور سلسلة تعدد الأضلاع هذه في العديد من طبولوجيا مع انتشار كل مكان في كل مكان سابق يرتبط بأحد مواقع الربط الثمانية5،6. يتم نقل يوبيكيتين بواسطة عملية انزيمية متعددة الخطوات (الشكل 1) حيث يرتبط C-terminus من كل مكان إلى واحدة من بقايا اليسين السبعة (K06، K11، K27، K29، K33، K48، أو K63) أو N-محطة من ubiquitin السابقة (يشار إليها باسم M1 أو كل مكان خطي)5،6. هذه الطوبولوجيا السلسلة هو المفتاح لمصير البروتين قيد التعديل. على سبيل المثال ، فإن التعديل مع سلسلة K48 أو K11 المرتبطة يؤدي إلى تدهور البروتين المعدل في proteasome ، في حين أن سلسلة خطية ضرورية لتنشيط إشارات NF-kB. وبالتالي، فإن التوزيع النسبي لهذه السلاسل من طبولوجيا ذات صلة بمجموعة واسعة من المسائل البيولوجية.
استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) هو ذات فائدة خاصة لتحليل طوبولوجيا سلسلة ubiquitin كما أنها لا تعتمد على التفاعلات القائمة على الأجسام المضادة أو تقارب القائم7،8، وكثير منها محدودة خصوصية ولا تفرق بين أنواع السلسلة المختلفة. وهناك احتمال مختلف للكشف هو استخدام المسوخ المعدلة وراثيا في كل مكان. هنا, يتم استبدال ليسين محددة للأرجينيين, التي لا يمكن أن تدعم التعديل عن طريق كل مكان. ثم يتم تفسير عدم وجود تشكيل سلسلة في كل مكان على بروتين الركيزة كدليل على طوبولوجيا محددة9.
ويستند تحديد MS القائم على البروتينات في كل مكان على حقيقة أن C-terminus من كل مكان يحتوي على بقايا أرجينين في الموقف 74 التي يتم التعرف عليها من قبل تريبسين أثناء إعداد بروتيوليك من العينات لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد, فصل الجليسين المزدوج C-المحطة الطرفية. هذا غليغلي (-GG) لا تزال تعلق على مجموعة الأمينية ε من بقايا اليسين من بروتين الركيزة. لتحليل طوبولوجيا في كل مكان، يحدث التعديل على واحدة من بقايا اليوزين السبعة في كل مكان. وهذا يخلق مجموعة من سبعة الببتيدات الرئيسية التي تحمل بقايا ليسين التي يتم تعديلها من قبل GG، محددة لكل من طبولوجيا(الشكل 2). على سبيل المثال، مع طوبولوجيا K06، سيتم حماية ال ليسين في الموقف 6 على تسلسل الأحماض الأمينية من الهضم المحاولة مع تعديل -GG من 114 دا إضافة إلى هذا اليوزين.
ويشار إلى تحديد الببتيدات محددة سلفا من قبل MS كما proteomics المستهدفة، أو على وجه التحديد، اقتناء الببتيدالمستهدفة 10. وقد تم تطوير طريقتين اعتمادا على أداء مطياف الكتلة المستخدمة. هذه هي رصد رد الفعل المختار (SRM) ، وتسمى أيضا رصد ردود الفعل المتعددة (MRM) ، ورصد التفاعل الموازي (PRM). SRM ينطوي على اختيار التحولات التي تتكون من السلائف م / ض والمنتج أيون م / ض. وعلى العكس من ذلك، لا يتطلب إجراء إعادة المتر سوى السلائف m/z. بعد التحديد، يتم إجراء مسح كامل لعملية مسح أيونات المنتج. هذا له ميزة أنه لا يوجد اختيار أيونات المنتج المناسب للكمية على مطياف الكتلة محددة ضروري قبل القياس11. ويمكن جدولة كل من إدارة الموارد البشرية واستراتيجية الحد من الفقر، اعتمادا على الصك. الجدولة هي ممارسة تعيين نافذة زمنية يتم خلالها تضمين أيون معين للتحليل ، حيث أن الببتيدات يتم تهييثها في أوقات احتجاز محددة من النظام الكروماتوغرافي. ويؤدي تخفيض عدد الأيونات التي يجري استجوابها في أي وقت من الأوقات إلى زيادة وتيرة استجواب تلك الأيونات المقرر إجراؤها في ذلك الوقت، مما يحسن دقة البيانات.
بشكل عام ، فإن تطبيق البروتيوميات المستهدفة لطبولوجيا كل مكان هو نفس أي تجربة بروتيوميات مستهدفة أخرى. ومع ذلك، هناك اختلافان رئيسيان مهمان: أولا، يجب النظر في استقرار سلاسل البيكيتين. هناك العديد من الإنزيمات القوية التي تتحلل بسرعة عند تحلل الخلايا. وproteases في كل مكان محددة تندرج في فئتين، وthioesterases و metalloproteases. معظم الهيدرولاسيس في كل مكان هي ثيويستراس وتحمل بقايا السيستين في مركزها النشط. عن طريق الألكيلات هذه بقايا السيستين، يمكن تعطيلها. على هذا النحو ، فإن استخدام مخازن تثبيت في كل مكان تحتوي على عوامل الألكيلات ، مثل N-ethylmaleimide (NEM) ، والمواد الكيميائية عالية الإزالة ، والحفاظ على العينات المبردة أمر حيوي لتحليل ناجح. ثانيا، على عكس التجارب المستهدفة الأخرى، يتم إصلاح خيار الببتيد. في تجربة نموذجية مستهدفة ، يمكن اختيار الببتيد البروتيوتيبيك لأداء كروماتوغرافي وتأين جيد. بالنسبة لبعض الببتيدات المميزة للطبولوجيا مثل K48 ، فإن هذه الخصائص جيدة ، بينما بالنسبة للآخرين ، فهي أقل جاذبية. على سبيل المثال ، K33 الكروماتوغرافيا في الإعداد نموذجية عكس المرحلة سيئة بسبب تشكيل ملف elution امتدت ، وضعف خصائص التأين من الببتيد K27 تقليل وضوحه من قبل MS12.
في هذا البروتوكول، ونحن نصف كيفية إجراء تقييم طوبولوجيا في كل مكان من عينة بيولوجية من قبل PRM. يتم تقديم بيانات مثال على الإجراء باستخدام اضطراب البروتيازوم باستخدام علاج مثبط MG-132 في عدة أنواع مختلفة من الخلايا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

تقييم الصورة العالمية للنوبولوجيا سلسلة في كل مكان داخل البروتيوم هو من المهم الإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. البروتوكول المبين هنا يستفيد من تعديل دي غليسين (-GG) المتبقي بعد الهضم المحاولة من يوبيكيتين أدرجت في سلسلة. من خلال تحديد كميا هذه الببتيدات ذات الخصائص الطوبولوجية يمكن تحديد الوفرة النسبية لكل طوبولوجيا سلسلة في كل مكان. وتفيد التقارير بأن الخطوات اللازمة لقياس هذه الببتيدات من خلال تجربة موازية لرصد التفاعل تأخذ في الاعتبار استقرار سلاسل كل مكان. يتم وصف إعداد الضوابط الثقيلة ، وتحلل الخلية ، والهضم جنبا إلى جنب مع إعداد مطياف الكتلة المناسبة وسير عمل تحليل البيانات. يتم تقديم مثال على مجموعة البيانات مع الاضطرابات في طوبولوجيا كل مكان ، مصحوبة بأمثلة عن كيفية تحسين البروتوكول يمكن أن تؤثر على النتائج. باتباع الخطوات المبينة ، سيتمكن المستخدم من إجراء تقييم عالمي لمناظر طوبولوجيا كل مكان في سياقه البيولوجي.

لإثبات استخدام تحليل سلسلة في كل مكان من قبل PRM ، تم اختيار ثلاثة خطوط الخلية: خط الخلية الميلانوما الماوس B16 ، وخطي الخلايا البشرية المشتركة A549 (الخلايا الظهارية السنية الغدية) وهيلا (خلايا سرطان عنق الرحم). نمت هذه الثقافات إلى مرحلة متوسطة في الوسائط المناسبة قبل أن يتم علاجها مع 0 أو 10 أو 1...

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring at JoVE.com

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

تصف هذه الطريقة تقييم التغيرات العالمية في طوبولوجيا سلسلة ubiquitin. ويتم التقييم بتطبيق نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي.

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

As different ubiquitin chain topologies have a broad range of biological effects, understanding changes in their abundance is relevant to a wide variety of biological states. Applying parallel reaction monitoring to ubiquitin chain analysis allows the specific identification and quantification of the ubiquitin chain topologies. Unlike typical PRM experiments, analysis of ubiquitin chain topology is restricted to specific modified peptides, many of which are not ideal for MS analysis.Visual demonstration of this technique highlights the adjustments and the expected results observed for these non-ideal peptides. Begin by preparing an ammonium bicarbonate solution, n-ethylmaleimide solution, and ubiquitin stabilization buffer as described in the text manuscript. Resuspend the biological sample in the ubiquitin stabilization buffer and lyse the cells with an appropriate method.After cell lysis, centrifuge the sample at 18, 000 times G for 10 minutes at four degrees Celsius and transfer the supernatant to a fresh low protein binding microcentrifuge tube. If necessary, store the samples at negative 20 degrees Celsius before proceeding. To thaw the samples, mix them rapidly with a ThermoMixer and do not use temperatures above 50 degrees Celsius.Once thawed, centrifuge the samples at 18, 000 times G for 10 minutes at four degrees Celsius and transfer 20 micrograms to a fresh low bind microcentrifuge tube, then adjust the volume to 50 microliters with ubiquitin stabilization buffer. Prepare a negative control with a normalized volume of ubiquitin stabilization buffer and a positive control with the buffer and commercially available chain types. Prepare a solution of 50 millimolar ammonium bicarbonate in water and adjust the pH to eight with one molar sodium hydroxide.Pellet an E.coli culture by centrifugation at 5, 000 times G for five minutes. Wash the cells twice with PBS and resuspend them in ubiquitin stabilization buffer at five micrograms per milliliter. Add one microgram of E.coli lysate to each sample and control.Then prepare 500 millimolar TCEP in MS Grade water and add it to each sample to a final concentration of 50 millimolar. Vortex the samples briefly and incubate them for 30 minutes at room temperature. Next, prepare a solution of 500 millimolar chloroacetaldehyde and ammonium bicarbonate and add it to the samples and controls to a final concentration of 55 millimolar.Vortex the samples briefly and incubate them in the dark for 20 minutes. Add Endopeptidase Lys-C to the samples and incubate them at 37 degrees Celsius for three hours. After the incubation, dilute the samples with 200 microliters of 50 millimolar ammonium bicarbonate, add trypsin, and incubate them for another 12 hours.On the next day, add 10%formic acid solution to each sample and control at a 1:10 volume-to-volume ratio. Verify that the pH is less than three. Then add 0.5 microliters of heavy peptide standard to each sample.After standard C18 sample cleanup, proceed with mass spectrometry analysis of the samples with a PRM-based methodology. To export the isolation list, select isolation list from the export menu, select the instrument type and set the method to standard. Click OK which will open a prompt to save a CSV file that can be used to create a PRM method.Next, import the scheduling run by selecting File, Import, and Results. Choose several files to import simultaneously and click OK, then select the files and wait for the import to complete. When ready, review the identifications by clicking on the mass for each heavy peptide entry.Correct recognition of the peak is often determined automatically, but manual curation may be required. Retention times selected for the heavy variants are also applied to the light versions, creating a schedule for the PRM. To modify the scheduling window, select the peak and click on Settings and Peptide Settings.Then change the time window in the Prediction tab. The schedule inclusion list can then be exported using File, Export, and Isolation List. Choose the appropriate instrument type, set method type to scheduled, and click OK.To analyze the data, import all samples and perform curation, removing transitions with interference or poor signal-to-noise ratios, then export data by either right-clicking on relevant graphs and selecting Copy Data or clicking on File, Export, and Report.Treatment with the proteasome inhibitor MG-132 prevents the degradation of ubiquitin conjugated proteins, which results in an increase of the K48 chain in the mouse melanoma cell line B16, as well as the two human cell lines, A549 and HeLa. Parallel reaction monitoring or PRM performs a full product ion scan after selection of the precursor ion, which means that product ions should be curated post run. The chromatogram for K48 is shown before and after curation.Product ions that have a signal with an inconsistent elution profile and low-intensity were removed. The transition selected during curation should be consistent between experiments, but may differ depending on chromatographic conditions, analysis settings, and the biological background of the sample. Shown here are typical product ion chromatograms for each of the identified ubiquitin chain topologies in this experiment.When designing a PRM experiment, collision energy can be optimized to improve the signal. When collision energies from 14 to 28 were applied, it was found that a higher collision energy of 26 was optimal for K63, while a lower energy of 18 was ideal for M1.Favorable collision energies were found for the topology characteristic peptides in this experiment and a selection of unmodified ubiquitin fragments, but they may need to be optimized based on the mass spectrometer and fragmentation method used. While attempting this procedure, it is important to remember that for ubiquitin chain analysis, a balance of conditions must be created to ensure that ubiquitin chain linkages are maintained whilst promoting their digestion into peptides.This method is vital for the understanding of ubiquitin signaling as it provides an accurate quantification of the ubiquitin chain topology. It could be combined with a pull-down or an organelle fractionation to address which ubiquitin chain topology is associated with the targeted protein sample.

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Abstract