TurboID-baseret nærhed mærkning for I Planta Identifikation af Protein-Protein Interaction Networks

Nærhedsmærkningsteknikker (PL) ved hjælp af manipuleret ascorbatperoxidase (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (kendt som BioID) er med succes blevet anvendt til identifikation af proteinproteininteraktioner (PPI) i pattedyrceller. Kravene til giftig hydrogenperoxid (H₂O₂) i APEX-baseret PL, længere inkubationstid med biotin (16-24 timer) og højere inkubationstemperatur (37 °C) i BioID-baseret PL begrænser imidlertid i alvorlig grad deres anvendelse i planter. Den nyligt beskrevne TurboID-baserede PL adresser mange begrænsninger af BioID og APEX. TurboID giver mulighed for hurtig nærhed mærkning af proteiner på bare 10 min under stuetemperatur (RT) betingelser. Selv om nytten af TurboID er blevet påvist i dyremodeller, vi for nylig viste, at TurboID-baserede PL klarer sig bedre i planter i forhold til BioID for mærkning af proteiner, der er proksimale til et protein af interesse. Forudsat her er en trin-for-trin protokol til identifikation af protein interaktion partnere ved hjælp af N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domæne af nukleotid-bindende leucin-rige gentage (NLR) protein familie som model. Metoden beskriver vektorkonstruktion, agroinfiltration af proteinekspressionskonstruktioner, biotinbehandling, proteinekstraktion og afsaltning, kvantificering og berigelse af de biotinyterede proteiner ved affinitetsrensning. Den protokol, der er beskrevet her, kan let tilpasses til at studere andre proteiner af interesse i Nicotiana og andre plantearter.