Rotulagem de proximidade baseada em turboid para identificação na planta de redes de interação proteína-proteína

Técnicas de rotulagem de proximidade (PL) utilizando ascorbate peroxidase (APEX) ou Escherichia coli biotin ligase BirA (conhecida como BioID) têm sido usadas com sucesso para identificação de interações proteína-proteína (PPIs) em células de mamíferos. No entanto, os requisitos de peróxido de hidrogênio tóxico (H₂O₂) em PL baseado em APEX, maior tempo de incubação com biotina (16-24 h) e maior temperatura de incubação (37 °C) em PL baseado em BioID limitam severamente suas aplicações em plantas. O PL baseado em TurboID recentemente descrito aborda muitas limitações do BioID e do APEX. TurboID permite rotulagem rápida de proximidade de proteínas em apenas 10 min sob condições de temperatura ambiente (RT). Embora a utilidade do TurboID tenha sido demonstrada em modelos animais, recentemente mostramos que o PL baseado em TurboID tem melhor desempenho em plantas em comparação com o BioID para rotulagem de proteínas que são proximais a uma proteína de interesse. Desde que aqui esteja um protocolo passo-a-passo para a identificação de parceiros de interação proteica usando o domínio n-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) da família de proteínas de nucleotídeo-binding leucina-rich repeat (NLR) como modelo. O método descreve construção vetorial, agroinfiltração de construtos de expressão proteica, tratamento de biotina, extração e dessalização de proteínas, quantificação e enriquecimento das proteínas biotinylated por purificação de afinidade. O protocolo descrito aqui pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas de interesse em Nicotiana e outras espécies vegetais.