Transkription-wide profilering af Protein-RNA interaktioner ved cross-linking og immunoprecipation medieret af FLAG-Biotin Tandem Rensning

RNA- og RNA-bindende proteiner (RBP' er) styrer flere biologiske processer. Den rumlige og tidsmæssige placering af RNA'er og ringmekanismer ligger til grund for den skrøbelige regulering af disse processer. En strategi kaldet CLIP-seq (krydsbinding og immunfrit) er udviklet til at indfange endogene protein-RNA interaktioner med UV cross-linking efterfulgt af immunoprecipitation. På trods af den udbredte brug af konventionel CLIP-seq-metode i RBP-studiet er CLIP-metoden begrænset af tilgængeligheden af antistoffer af høj kvalitet, potentielle forurenende stoffer fra de copurified RBP'er, kravet om isotopmanipulation og potentielt tab af oplysninger under en kedelig forsøgsprocedure. Her beskriver vi en modificeret CLIP-seq metode kaldet ^FbioCLIP-seq ved hjælp af FLAG-biotin tag tandem rensning. Gennem tandemrensning og strenge vaskebetingelser fjernes næsten alle interagerende RNA-bindende proteiner. De RNA'er, der indirekte medieres af disse copurified RBP'er, er således også reduceret. Vores ^FbioCLIP-seq-metode muliggør effektiv påvisning af direkte proteinbundne RNA'er uden SDS-PAGE- og membranoverførselsprocedurer på en isotopfri og proteinspecifik antistoffri måde.