Cuantificación de parámetros espaciotemporales de la exocitostosis celular en células micropatr babeadas

Resumen

Las imágenes en vivo de la exocitosis lisosomal en células micropatrnadas permiten una cuantificación espacial de este proceso. La normalización de la morfología utilizando micropatrón es una herramienta excepcional para descubrir reglas generales sobre la distribución espacial de los procesos celulares.

Resumen

Las imágenes en vivo de la proteína de membrana asociada al pHluorin etiquetada Soluble N-etillmaleimida-factor Accesorio REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana asociada al Vesículo 7 (VAMP7) por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) es una manera sencilla de explorar la secreción del compartimento lisosomal. Aprovechando el cultivo celular en superficies micropatrieras para normalizar la forma celular, se emplearon una variedad de herramientas estadísticas para realizar un análisis espacial de los patrones secretores. Usando la función K de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana (NND), confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio, sino que muestra clustering significativo. Cabe destacar que nuestro análisis reveló que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas de no adherencia, lo que indica que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Aún así, descubrimos que la adhesión celular mejora la agrupación en clústeres. Además de las áreas adhesivas y nodhesivas definidas con precisión, la geometría circular de estos micropatrón permite el uso de coordenadas polares, simplificando los análisis. Utilizamos la estimación de densidad de núcleo (KDE) y la función de distribución acumulativa en coordenadas polares de eventos de exocitosis para identificar áreas enriquecidas de exocitosis. En las células de micropatrón en forma de anillo, la agrupación se produjo en el borde entre las áreas adhesivas y nodhesivas. Nuestro análisis ilustra cómo se pueden emplear herramientas estadísticas para investigar las distribuciones espaciales de diversos procesos biológicos.

Introducción

La exocitosis es un proceso celular universal en el que una vesícula se fusiona con la membrana plasmática y libera su contenido. La vesícula puede fusionarse totalmente con la membrana plasmática (fusión completa) o crear un poro de fusión que permanece abierto durante un tiempo limitado (beso y carrera)¹. Por ejemplo, las proteínas recién sintetizadas se liberan en el medio extracelular a partir de vesículas que provienen del complejo Golgi. Esta vía biosintética y anterograda es primordial, especialmente en organismos multicelulares, para secretar péptidos de señalización (por ejemplo, hormonas, neurotransmisores) y componentes de matriz ext....

Protocolo

1. Preparación de células micropatrnadas

1. Transfección de células
   1. Un día antes de la transfección, la semilla 2,5 x 10⁶ hTERT-RPE1 células en un pocero de una placa de 12 pozos (2 x 2 cm) en 1 ml de medio.
   2. El día de la transfección, preparar la mezcla de transfección con plásmido VAMP7-pHluorin (100 l de tampón, 0,8 g de ADN, 3 l de mezcla de transfección). Incubar durante 10 min.
      NOTA: VAMP7 es un lysosomal v-SNARE, fusionado con una etiqueta de pHluorin luminal. La sonda de pHluorin se apaga por pH bajo, pero durante la exocitosis se liberan protones y la pHluorina comienza a emitir una señal^10,,....

Resultados

Las características espaciotemporales de los eventos de exocitosis se analizaron a partir de lisosomas visualizados por VAMP7-pHluorin^10,,11 en células hTert-RPE1. Las células hTert-RPE1 son células notransformadas que adoptan bien a la micropatrón y se han utilizado ampliamente en estudios anteriores basados en micropatrón^4,,14. VAMP7 es un lisosomal v-SNARE¹⁵ que fue etique.......

Discusión

Monitoreamos los eventos de exocitosis desde el compartimento lisosomal por imágenes de células vivas TIRFM de VAMP7-pHluorin en células normalizadas con micropatrón en forma de anillo y realizamos un análisis estadístico riguroso de los parámetros espaciales de los eventos de exocitosis. Empleando la función K transformada de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana, confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio^8,,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.