Cuantificación de parámetros espaciotemporales de la exocitostosis celular en células micropatr babeadas

Resumen

Las imágenes en vivo de la exocitosis lisosomal en células micropatrnadas permiten una cuantificación espacial de este proceso. La normalización de la morfología utilizando micropatrón es una herramienta excepcional para descubrir reglas generales sobre la distribución espacial de los procesos celulares.

Resumen

Las imágenes en vivo de la proteína de membrana asociada al pHluorin etiquetada Soluble N-etillmaleimida-factor Accesorio REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana asociada al Vesículo 7 (VAMP7) por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) es una manera sencilla de explorar la secreción del compartimento lisosomal. Aprovechando el cultivo celular en superficies micropatrieras para normalizar la forma celular, se emplearon una variedad de herramientas estadísticas para realizar un análisis espacial de los patrones secretores. Usando la función K de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana (NND), confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio, sino que muestra clustering significativo. Cabe destacar que nuestro análisis reveló que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas de no adherencia, lo que indica que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Aún así, descubrimos que la adhesión celular mejora la agrupación en clústeres. Además de las áreas adhesivas y nodhesivas definidas con precisión, la geometría circular de estos micropatrón permite el uso de coordenadas polares, simplificando los análisis. Utilizamos la estimación de densidad de núcleo (KDE) y la función de distribución acumulativa en coordenadas polares de eventos de exocitosis para identificar áreas enriquecidas de exocitosis. En las células de micropatrón en forma de anillo, la agrupación se produjo en el borde entre las áreas adhesivas y nodhesivas. Nuestro análisis ilustra cómo se pueden emplear herramientas estadísticas para investigar las distribuciones espaciales de diversos procesos biológicos.

Introducción

La exocitosis es un proceso celular universal en el que una vesícula se fusiona con la membrana plasmática y libera su contenido. La vesícula puede fusionarse totalmente con la membrana plasmática (fusión completa) o crear un poro de fusión que permanece abierto durante un tiempo limitado (beso y carrera)¹. Por ejemplo, las proteínas recién sintetizadas se liberan en el medio extracelular a partir de vesículas que provienen del complejo Golgi. Esta vía biosintética y anterograda es primordial, especialmente en organismos multicelulares, para secretar péptidos de señalización (por ejemplo, hormonas, neurotransmisores) y componentes de matriz extracelular (por ejemplo, colágeno), así como para traficar proteínas transmembranas a la membrana plasmática. Además, las secreciones pueden ocurrir de diferentes endosomas: 1) reciclar endosomas con el fin de reutilizar las proteínas transmembranas; 2) cuerpos multivesiculares (MVB) para liberar exosomas; y 3) lisosomas para la liberación de enzimas proteolíticas. Se ha demostrado que la secreción endosomal es importante para el crecimiento de la neurita, la formación de pseudopodias, la reparación de la membrana plasmática y la señalización dependiente de ATP^2.

Para estudiar la exocitosis a nivel de una sola célula, se han empleado varias técnicas. Patch-clamp permite la detección de eventos de exocitosis individuales con una alta resolución temporal en una amplia variedad de células vivas^3. Sin embargo, este método no proporciona información sobre la localización de eventos de exocitosis, ni desde qué compartimiento se produce. La microscopía electrónica permite la visualización directa de eventos excíticos con alta resolución espacial, y en combinación con el inmunoetiquetado proporciona información sobre la especificidad de los compartimentos y moléculas involucrados. Una desventaja de este enfoque es la falta de información sobre la dinámica del proceso, así como su incapacidad para realizar estudios de alto rendimiento. Los enfoques de microscopía ligera, como la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), que explota el campo evanescente para iluminar los fluoróforos en las proximidades del cubreobjetos (100 nm), proporciona una buena resolución temporal y espacial para estudiar eventos de exocitosis. Sin embargo, este método sólo es compatible con las células adherentes y sólo se puede aplicar a la parte ventral/inferior de las células.

Cabe destacar que la membrana plasmática revela una heterogeneidad significativa basada en complejos adhesivos que están presentes sólo en áreas restringidas. Esta heterogeneidad restringe, por ejemplo, la captación de diferentes ligandos⁴. Del mismo modo, recientemente se ha informado de que la secreción del complejo Golgi se concentra en "puntos calientes" en la membrana plasmática⁵. Además, se sabe que ciertas cargas se secretan a través de la exocitosis asociada a la adhesión focal⁶. Por lo tanto, se debe prestar especial atención a la cuestión de si los eventos de exocitosis se distribuyen aleatoriamente en el espacio, o si se concentran en áreas específicas de la membrana plasmática. Se han propuesto varias herramientas estadísticas basadas en la función K de Ripley para explorar estas preguntas^7,,8,,9. Nuestro enfoque combina estas herramientas con micropatrón para controlar la forma celular y la heterogeneidad de la membrana plasmática. Además de proporcionar un medio para distinguir entre áreas adhesivas y no adhesivas, esta técnica también permite la comparación entre diferentes células y condiciones y aumenta el poder de los análisis estadísticos.

Aquí empleamos una variedad de herramientas estadísticas para estudiar la distribución espacial de eventos de exocitosis desde el compartimiento lisosomal monitoreado por imágenes de células vivas TIRFM de VAMP7-pHluorin en células hTert-RPE1 normalizadas en forma de anillo. Se confirmó que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio^8,9 y que los eventos de exocitosis exhiben agrupación. Cabe destacar que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas no nadhesivas, lo que indica que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Sin embargo, la adhesión celular mejoró la agrupación en clústeres. Consistentemente, nuestro análisis identificó áreas enriquecidas de exocitosis que se encontraban en la frontera entre las áreas adhesivas y no nadhesivas.

Protocolo

1. Preparación de células micropatrnadas

1. Transfección de células
   1. Un día antes de la transfección, la semilla 2,5 x 10⁶ hTERT-RPE1 células en un pocero de una placa de 12 pozos (2 x 2 cm) en 1 ml de medio.
   2. El día de la transfección, preparar la mezcla de transfección con plásmido VAMP7-pHluorin (100 l de tampón, 0,8 g de ADN, 3 l de mezcla de transfección). Incubar durante 10 min.
      NOTA: VAMP7 es un lysosomal v-SNARE, fusionado con una etiqueta de pHluorin luminal. La sonda de pHluorin se apaga por pH bajo, pero durante la exocitosis se liberan protones y la pHluorina comienza a emitir una señal^10,,11.
   3. Agregue la mezcla de transfección a las células en su medio.
   4. Cambie el medio 4 h después de añadir la mezcla de transfección en las células.
   5. Utilice las células para experimentos durante las próximas 24–48 h.
2. Preparación de micropatrón (método de fotolitografía)
   1. Lavar los cubreobjetos (25 mm de diámetro) en etanol y dejarlos secar durante 5 min.
   2. Activar los cubreobjetos mediante la iluminación bajo UV profundo durante 5 min.
   3. Cree una cámara húmeda humidificando completamente una toalla de papel en la que se coloca una película de parafina. Añadir gotas (30 ml para el cubreobjetos de 22 mm) de la solución de poli-L-lisina-injerto-polietileno glicol (PLL-g-PEG) (0,1 mg/ml, 10 mM HEPES, pH a 7,4) y colocar cubreobjetos con la superficie activada en ellos. Cierre la cámara húmeda con una parte superior e incubar los cubreobjetos durante 1 h.
   4. Lavar los cubreobjetos 2x en PBS y 1x en agua destilada y dejar que se sequen.
   5. Lave la fotomasca de cuarzo con agua destilada y luego con etanol o propanol. Seque la fotomasca con flujo de aire filtrado.
      NOTA: La fotomasca de cuarzo está recubierta en un lado con cromo antirreflecttivo que contiene agujeros en forma de micropatrón. En este protocolo se utiliza una fotomasca que contiene micropatrones en forma de anillo de 37 m. Cuando uv profundo es brillante en la fotomasca, la luz sólo puede pasar a través de estos agujeros¹².
   6. Exponga la fotomasca (lado cromado) a UV profundo durante 5 minutos para limpiar la superficie.
   7. Agregue pequeñas gotas de agua (10 ml para un cubreobjetos de 20 mm) en el lado cromado de la fotomasca. Coloque el cubreobjetos con su lado tratado con PLL-g-PEG en la gota y seque el agua extra. Asegúrese de que no se formen burbujas de aire entre la máscara y los cubreobjetos.
      NOTA: La fuerza capilar del agua inmovilizará los cubreobjetos.
   8. Exponga la fotomasca a UV profundo durante 5 minutos con el lado no cromado hacia arriba (los cubreobjetos están unidos en la superficie inferior).
      NOTA: La luz sólo puede pasar a través de los orificios y modificar la superficie tratada con PLL-g-PEG de los cubreobjetos debajo de la fotomasca.
   9. Retire los cubreobjetos de la fotomasca añadiendo el exceso de agua.
      NOTA: Los cubreobjetos deben flotar rápidamente.
   10. Incubar los cubreobjetos en una solución de proteínas de matriz extracelular (50 g/ml de fibronectina, 5 g/ml de fibrinógeno fluorescente diluido en agua) sobre película de parafina en una cámara húmeda (como en el paso 1.2.3) durante 1 h bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.
       NOTA: El experimento se puede pausar en este punto almacenando los cubreobjetos en PBS a 4 oC.
3. Siembra celular en superficies micropatrnadas
   1. Utilice un soporte de cubreobjetos magnético que se ajuste al tamaño de los cubreobjetos micropatrnados para montar los cubreobjetos. El día de la adquisición, caliente el soporte de cubreobjetos a 37 oC para evitar el choque térmico de las células durante los pasos posteriores.
   2. Preparar el medio de patrón complementando el medio DMEM/F12 con 20 mM HEPES y 2% de penicilina/estreptomicina.
   3. Coloque los cubreobjetos en el soporte con el lado micropatrnado hacia arriba y agregue el medio de patrón tan pronto como el cubreobjetos esté en la base del soporte. Agregue el sello e inmovilice con el dispositivo magnético. Llene el soporte del cubreobjetos con el medio de patrón y ciérrelo con la tapa de vidrio.
      NOTA: Sea rápido, para no permitir que el cubreobjetos se seque. No lave el soporte de cubreobjetos con etanol entre experimentos, ya que el sello podría retener un poco de etanol, que puede reaccionar con PLL-g-PEG y provocar estrés celular. Lave el soporte del cubreobjetos solo con agua jabonosa. Por otra parte, la articulación se puede incubar en el medio de patrón a 37 oC durante 1 h para diluir el producto residual.
   4. Recoger las células hTERT-RPE1 transfectosas por tripsinización (0,5 ml para una placa de 12 pozos) y añadir 1 ml de 10% FBS DMEM/F12 medio.
   5. Agregue 0,5 x 10⁶ células hTERT-RPE1 transfectadas al soporte del cubreobjetos y vuelva a cerrarlo. Incubar durante 10 min en la incubadora.
   6. Lavar el soporte de cubreobjetos 5x con un medio de patrón para eliminar las células noinuadas y el FBS residual añadiendo el medio de patrón con una pipeta y aspirando el medio con otra pipeta para crear un flujo de lavado. Mantenga siempre un pequeño volumen de patrón medio en el soporte del cubreobjetos para evitar el secado de las células en el cubreobjetos micropatrnados, lo que conducirá a la muerte celular.
   7. Incubar en la incubadora durante 3 h para permitir la propagación de células completas.

2. Adquisición de datos de exocitosis

1. Imágenes de eventos de exocitosis
   1. Coloque el soporte de cubreobjetos bajo un TIRM. La señal tiene que ser detectada por una cámara sensible configurada con el mejor formato de imagen disponible.
      NOTA: En este experimento, se utilizó un objetivo de lente 100x y una cámara EMCCD con una región de detección de 512 x 512 píxeles que daba lugar a un tamaño de píxel de 160 nm.
   2. Busque una celda que exprese VAMP7-pHluorin que esté completamente extendida (Figura 1A).
      NOTA: Las celdas que expresan VAMP7 son claramente identificables, porque exhiben una señal verde.
   3. Cambie el ángulo del láser hasta que se alcance un ángulo TIRF que permita la visualización de eventos de exocitosis VAMP7-pHluorin. Realizar una adquisición de 5 minutos a una frecuencia compatible con la velocidad de exocitosis y la escala de tiempo (normalmente 3 Hz, Figura 1D) utilizando el software del microscopio.
      NOTA: Las células hTERT-RPE1 tienen una tasa de secretoría lisosomal de alrededor de 0,3 Hz en micropatrón. La exocitosis lisosomal tiene una duración típica de 1 s. Se caracteriza por una intensidad máxima seguida de una decadencia exponencial. La difusión de la sonda debe ser evidente en este momento(Figura 1B, C).
   4. Para cada célula, también realice una adquisición del micropatrón utilizando el software del microscopio (Figura 1A).
2. Adquisición de coordenadas de exocitosis
   1. Abra la película adquirida con ImageJ/FIJI. Usar archivo ?? Importación ? Secuencia de imágenes. Encuentra eventos de exocitosis por ojo. Un evento de exocitosis se caracteriza por la aparición de una señal brillante que se extiende hacia afuera (Figura 1).
   2. Utilice la herramienta de punto para marcar el centro del evento exocítico. Usar analizar ( Use Analyze) Medir para medir las coordenadas X e Y, así como la coordenada temporal (número de sector). Realice estas mediciones para todos los eventos de exocitosis de la película.
   3. Guardar los resultados (Resultados ? Archivo ? Guardar como). Prepare un archivo de texto para cada celda analizada denominada "Results(cell_name).txt" que contenga el sector, las coordenadas X y las coordenadas Y para todos los eventos de exocitosis en ese orden.
      
      Se supone que el archivo de texto tiene este aspecto:
      Radio de diámetro de ID X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      NOTA: Tenga cuidado de reemplazar todas las comas por puntos.
   4. Mida el centro y el diámetro de cada celda usando la"Herramienta Oval". Ajuste un círculo perfecto (no utilice un óvalo) y use"Medida"para obtener las coordenadas X e Y y el diámetro de Feret. Guarde la identidad de cada celda (ID), las coordenadas X e Y, el diámetro y el radio de Feret (diámetro/2) en un archivo de texto denominado "Spherical parameter.txt".
      
      Se supone que el archivo de texto tiene este aspecto:
      Radio de diámetro de ID X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      NOTA: Tenga cuidado de reemplazar todas las comas por puntos.
   5. Mida el grosor del anillo de micropatrón (longitud de adhesión) con la herramienta recta y guarde el ID de celda, el radio de celda (del archivo: "Parámetro esférico.txt") y la longitud de adhesión en un archivo de texto denominado "Parámetro de patrón.txt". Calcule la longitud de adhesión normalizada dividiendo la longitud de adhesión por el radio de celda.
      NOTA: Tenga cuidado de reemplazar todas las comas por puntos.
      
      El archivo debe tener este aspecto:
      Longitud de adhesión del radio de la célula ID Longitud de adhesión normalizada
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. Análisis espacial de una sola célula

1. Paquete R e instalación
   NOTA: El paquete R para este análisis aprovecha el paquete¹³ de Spatstat para calcular la densidad bidimensional (2D) y la función K de Ripley. El código es de código abierto y utiliza archivos de texto que se han descrito anteriormente.
   1. Descargar e instalar R desde https://www.r-project.org/ (la versión 3.5.2 se utilizó en este análisis).
   2. Descargue el paquete (y el conjunto de datos de demostración) de: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
   3. Instale el paquete en R Studio utilizando "Herramientas" usando "Instalar paquetes". Seleccione "Archivo de archivo de paquetes (.zip; .tar.gz)" para la categoría " Instalardesde:" y elija el archivo de paquete. Pulse "Instalar".
   4. Cargue el paquete con la función "library("ExocytosisSpatialAnalysis")" escribiendo este comando en R studio y presionando "Enter".
   5. Ejecute el paquete con la función "ESA()" escribiendo este comando en R studio y pulsando "Enter".
      NOTA: Se abrirá una interfaz de usuario.
   6. Seleccione el directorio para el conjunto de datos (archivos .txt) y un directorio para los trazados de salida.
      NOTA: Los parámetros del análisis (ver texto a continuación) se pueden cambiar a través de una interfaz de usuario.
   7. Este script se iniciará automáticamente y realizará el análisis. Proporciona archivos .pdf de las gráficas correspondientes y archivos .txt que contienen resultados numéricos.

Resultados

Las características espaciotemporales de los eventos de exocitosis se analizaron a partir de lisosomas visualizados por VAMP7-pHluorin^10,,11 en células hTert-RPE1. Las células hTert-RPE1 son células notransformadas que adoptan bien a la micropatrón y se han utilizado ampliamente en estudios anteriores basados en micropatrón^4,,14. VAMP7 es un lisosomal v-SNARE¹⁵ que fue etique...

Discusión

Monitoreamos los eventos de exocitosis desde el compartimento lisosomal por imágenes de células vivas TIRFM de VAMP7-pHluorin en células normalizadas con micropatrón en forma de anillo y realizamos un análisis estadístico riguroso de los parámetros espaciales de los eventos de exocitosis. Empleando la función K transformada de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana, confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio^8,,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.