Microwaving und Fluorophor-Tyramid für Multiplex-Immunostainierung auf Maus-Adrenals – Verwendung von unkonjugierten Primärantikörpern aus den gleichen Wirtsarten

Immunostaining ist weit verbreitet in der biomedizinischen Forschung verwendet, um die zelluläre Expression Muster eines bestimmten Proteins zu zeigen. Multiplex-Immunostainierung ermöglicht die Etikettierung mit mehreren primären Antikörpern. Um die Antikörper-Kreuzreaktivität zu minimieren, erfordert multiplexe Immunfärbung mit indirekter Färbung unbeschriftete Primärantikörper verschiedener Wirtsarten. Die geeignete Kombination verschiedener Artenantikörper ist jedoch nicht immer verfügbar. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verwendung unbeschrifteter Primärantikörper derselben Wirtsart (z.B. in diesem Fall stammen beide Antikörper von Kaninchen) zur Multiplex-Immunfluoreszenz auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Mausnebennierenabschnitten. Bei dieser Methode wird das gleiche Verfahren und die gleichen Reagenzien verwendet, die im Antigen-Retrieval-Schritt verwendet werden, um die Aktivität des zuvor gebeizten Primärantikörperkomplexes zu entfernen. Die Dias wurden mit dem ersten primären Antikörper mit einem allgemeinen Immunfleckenprotokoll befleckt, gefolgt von einem Bindungsschritt mit einem biotinylierten Sekundärantikörper. Dann wurde eine Avidin-Biotin-Peroxidase-Signalentwicklungsmethode mit Fluorophor-Tyramid als Substrat verwendet. Die Immunaktivität des ersten primären Antikörperkomplexes wurde durch Eintauchen in eine Mikrowellen-Koch-Natriumcitratlösung für 8 min abgestreift. Die unlösliche Fluorophor-Tyramid-Ablagerung blieb auf der Probe, wodurch der Schlitten mit anderen primären Antikörpern gefärbt werden konnte. Obwohl diese Methode die meisten falsch positiven Signale eliminiert, kann ein gewisser Hintergrund von Antikörper-Cross-Reaktivität bleiben. Wenn die Proben mit endogenem Biotin angereichert sind, kann ein peroxidasekonjugierter Sekundärantikörper verwendet werden, um den biotinylierten Sekundärantikörper zu ersetzen, um das falsche Positiv aus wiedergewonnenem endogenem Biotin zu vermeiden.