Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

In questo articolo, diamo istruzioni pratiche per ottenere dati translatomi da diversi tipi di cellule della radice di Arabidopsis thaliana tramite il metodo di purificazione dell'affinità del ribosoma di traduzione (TRAP) e la preparazione consecutiva della libreria a basso input.

Come materiale di partenza, impieghiamo linee vegetali che esprimono RPL18 di proteine ribosomiche marcate tramite GFP in modo specifico del tipo di cellula mediante l'uso di promotori adeguati. Prima dell'immunopurificazione e dell'estrazione dell'RNA, il tessuto viene congelato allo snap, che conserva l'integrità dei tessuti e contemporaneamente consente l'esecuzione di studi di serie temporali ad alta risoluzione temporale. In particolare, le strutture delle pareti cellulari rimangono intatte, il che è uno dei principali inconvenienti nelle procedure alternative come gli approcci basati sullo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza che si basano sulla protonodurata dei tessuti per isolare popolazioni cellulari distinte. Inoltre, non è necessaria alcuna fissazione dei tessuti come nelle tecniche basate sulla microdissezione di cattura laser, che consente di ottenere RNA di alta qualità.

Tuttavia, il campionamento dalle sottopopolazioni di cellule e solo l'isolamento dell'RNA associato al polisomo limita gravemente la resa dell'RNA. È quindi necessario applicare metodi di preparazione della libreria sufficientemente sensibili per una corretta acquisizione dei dati da parte dell'RNA-seq.

TRAP offre uno strumento ideale per la ricerca sulle piante, poiché molti processi di sviluppo coinvolgono percorsi di segnalazione meccanica e correlati alle pareti cellulari. L'uso di promotori per colpire specifiche popolazioni di cellule sta colmando il divario tra il livello di organo e a livello di singola cellula che a sua volta soffrono di poca risoluzione o di costi molto elevati. Qui, applichiamo il TRAP per studiare la comunicazione cellulare nella formazione laterale della radice.