B.N.B. y T.H. reconocen la financiación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) en el marco de la Estrategia de Excelencia de Alemania – EXC-2193/1 – 390951807, gef-rdert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der L'nder – EXC-2193/1 – 390951807, y conceder HU 997/1-13 (proyecto n.o 420798410). M.G. reconoce el apoyo parcial en el marco del Proyecto LOEWE iNAPO por el Ministerio de Educación Superior, Investigación y Artes del Estado de Hessen. Agradecemos al Dr. Wolfgang Bronner y a la Dra. Agne Zukauskaite del Instituto Fraunhofer de Física de Estado Sólido Aplicada IAF por la donación de obleas de silicio recubiertas de oro de alta calidad.

NOTA: Consulte la Figura 1 para obtener información general sobre el esquema.
1. Configuración del reactivo
NOTA: Los polímeros utilizados para este protocolo son: malémida-polietileno glicol-trietoxisilano (silano-PEG-mal, 5 kDa), tiol-polietileno glicol-tiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), tiol terminado poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 kDa) y tiol terminado de poliestireno (PS-SH, 1.3 mDa).
<ol><li>Preparar la masa molar bien definida y alta PNiPAM-SH a través de la polimerización radical de transferencia de átomos, seguida de la conversión y reducción del grupo final funcional para la introducción de una mitad tiol, como se describe en la literatura18. Consulte la Figura 1 para ver las estructuras detalladas.</li>
	<li>Para el almacenamiento de los productos químicos, preparar alícuotas más pequeñas dentro de un sistema de guantera seca con atmósfera de nitrógeno para evitar la exposición al oxígeno atmosférico y la humedad. PEG y PNiPAM son higroscópicos45,,46 y se sabe que los grupos finales funcionales de PEG, PNiPAM y PS se oxidan fácilmente cuando se almacenan en condiciones ambientales33,47,48. Todos los productos químicos deben almacenarse a -20 oC.</li>
	<li>Utilice disolventes de grado analítico o superior. Además, utilice agua ultrapura para enjuagar chips de voladizos AFM y cristalería porque los experimentos de una sola molécula son muy sensibles a toda contaminación.</li>
</ol>2. Configuración del equipo
NOTA: Utilice pinzas y vasos de acero inoxidable o vidrio. Utilice pinzas invertidas para un agarre seguro (por ejemplo, el modelo R3 SA que tiene una constante de resorte bajo).
<ol><li>Prepare la solución RCA (agua ultrapura, peróxido de hidrógeno y amoníaco (5:1:1)) para limpiar cristalería y pinzas.</li>
	<li>Coloque los recipientes en un vaso de precipitados y llénelo con RCA hasta que la cristalería o las pinzas estén completamente cubiertas.</li>
	<li>Calentar el vaso de precipitados del paso 2.2 durante 1 h a 80oC.</li>
	<li>Enjuague los recipientes posteriormente con agua ultrapura hasta que ya no se pueda determinar ningún olor penetrante (al menos tres veces).</li>
	<li>Cristalería y pinzas secas en un horno (120oC).</li>
</ol>3. Funcionalización de la punta
NOTA: Todos los pasos deben llevarse a cabo en una campana de humos para evitar la inhalación de vapores orgánicos. Además, se requieren guantes, bata de laboratorio y protección ocular. Utilice guantes de nitrilo o látex para cada paso para evitar la contaminación. Use guantes resistentes a disolventes cuando utilice tolueno. Todos los pasos, a menos que se especifique lo contrario, se realizan en RT. Use equipos y guantes frescos para cada paso para evitar una posible contaminación cruzada.
<ol><li>Realice la activación de la superficie aplicando plasma de oxígeno al chip voladizo AFM MLCT-Bio-DC. NOTA: La eficiencia del tratamiento plasmático para la funcionalización adicional es escalada con el contenido de oxígeno en la cámara de plasma.<ol>
<li>Utilice pinzas recién limpias para colocar chips voladizos AFM en una cámara de plasma (40 kHz, 600 W).</li>
		<li>Utilice el programa de activación modificado a medida: evacuación (0,1 mbar) – inundación con oxígeno a una presión de: 0,2 mbar (4 min) – proceso de plasma (potencia: 40%, duración: 2 min, presión de proceso: 0,2 mbar).</li>
		<li>Ventile la cámara y continúe con el paso 3.2.2 inmediatamente para evitar cualquier adsorción de contaminantes a las virutas en voladizo AFM del aire.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanización y PEGylation NOTA: El tiempo es un parámetro crítico entre los pasos. Prepare soluciones lo más frescas posible durante los tiempos de espera. Los grupos de maleimidas están sujetos a hidrólisis en medios acuosos y los tioles se oxidan fácilmente a disulfuros en la solución33,,47 impidiendo las reacciones de funcionalización de la punta AFM.<ol>
<li>Preparar una solución de silano-PEG-mal en tolueno (1,25 mg/ml) en tubos de plástico o vidrio resistentes a disolventes y verter 6 ml de la solución en platos plántes planos, 3 ml cada uno. NOTA: Si se observa la unión de múltiples polímeros de sonda en el experimento SMFS, mezclar silane-PEG-mal con silane-PEG no funcional puede reducir el número de puntos de anclaje. Para el ajuste de la capa de pasivación PEG con diferentes masas (es decir, longitudes de contorno) se puede utilizar27.</li>
		<li>Incubar los chips voladizos AFM inmediatamente después del paso 3.1.3 en la solución silano-PEG-mal (hasta 10 chips por plato Petri) durante 3 h a 60 oC35.</li>
		<li>Saque los platos de Petri del horno y deje que la solución se enfríe durante al menos 10 minutos.</li>
		<li>Enjuague cada chip voladizo AFM con cuidado. Reduzca el impacto de las fuerzas capilares en el voladizo AFM al pasar la interfaz aire-solvente, por ejemplo inclinando estas virutas ligeramente al sumergirse en solución.<ol>
<li>Para polímeros PEG y PS, enjuague tres veces con tolueno.</li>
			<li>Para el polímero PNiPAM, enjuague una vez con tolueno y dos veces con etanol.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elija al menos dos chips voladizoS AFM como chips voladizoS AFM de control, omitiendo el paso 3.3 y enjuáguelos de la siguiente manera para aumentar la polaridad del disolvente:<ol>
<li>Para polímeros PEG y PS, enjuague dos veces con etanol y una vez con agua ultrapura.</li>
			<li>Para el polímero PNiPAM, enjuague dos veces con agua ultrapura. NOTA: Los chips voladizo SFM de control han pasado por todos los pasos de funcionalización, excepto el accesorio de polímero (paso 3.3). Sirven para demostrar la limpieza del proceso de funcionalización, el sistema de soporte de viruta en voladizo AFM, las superficies y los disolventes utilizados para el experimento SMFS.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Fijación de polímero covalente NOTA: Aunque se espera que la punta del voladizo AFM esté completamente cubierta con grupos de maleimida, hay sólo unos pocos sitios de unión para el polímero de sonda única, porque la malémida sufre hidrólisis en el agua que conduce a PEGs inactivos47. Estos PEG inactivos actúan como una capa de pasivación, como se describió anteriormente.<ol>
<li>Incubar chips voladizo AFM directamente después del paso 3.2.5 en una de las siguientes soluciones de polímeros en platos Petri de 3 ml. Si el polímero respectivo no se disuelve correctamente, utilice un baño de agua a 40 oC y revuelva bien la solución. NOTA: Dado que el uso de polímeros terminados con tiol podría conducir a la formación de enlaces de disulfuro que obstaculizan la reacción con los grupos de maleimida de silano-PEG-mal, se recomienda un agente reductor, en particular si se aplica el paso 3.3 en los tampones acuosos para los polímeros solubles en agua33.<ol>
<li>Para polímeros PEG y PS, utilice una concentración de 1,25 mg/ml en tolueno durante 1 h a 60 oC.</li>
			<li>Para polímeros PNiPAM, utilice una concentración de 1,25 mg/ml en etanol durante 3 h a RT. NOTA: Si se observa la unión de múltiples polímeros de sonda en el experimento SMFS, se debe reducir la concentración del polímero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Enjuague cuidadosamente cada chip voladizo AFM.<ol>
<li>Para polímeros PEG y PS, enjuague dos veces con tolueno, dos veces con etanol y una vez con agua ultrapura después de un enfriamiento de 10 minutos.</li>
			<li>Para polímeros PNiPAM, enjuague dos veces con etanol y dos veces con agua ultrapura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Almacene cada chip en voladizo AFM por separado en una pequeña placa Petri (1 ml) llena de agua ultrapura a 4 oC hasta su uso en un experimento.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Preparación de la superficie
<ol><li>Oblea de óxido de silicio NOTA: Esta superficie se utilizó para SMFS con PEG y PNiPAM.<ol>
<li>Cortar una oblea de óxido de silicio en trozos pequeños usando un cuchillo de diamante.</li>
		<li>Coloque las piezas de óxido de silicio por separado en tubos de microcentrífuga y llene estos tubos con etanol.</li>
		<li>Sonicar las piezas de óxido de silicio durante 10 min.</li>
		<li>Enjuague las piezas de óxido de silicio con etanol dos veces y séquelas bajo un flujo de nitrógeno cuidadosamente. Utilice las piezas de óxido de silicio inmediatamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monocapa autoensamblada de alcano hidrófobo tiol sobre oro (SAM) NOTA: Esta superficie se utilizó para SMFS con PS. Consulte la literatura39,49 para obtener más información sobre los SAM.<ol>
<li>Utilice una oblea de silicio recubierta de oro (A [100], titanio de 5 nm, oro de 100 nm) para realizar los pasos 4.1.1 – 4.1.4.</li>
		<li>Incubar las piezas superficiales en una solución de 1 dodecantiol (2 mM) durante 18 h.</li>
		<li>Enjuague dos veces los SAM recién preparados en etanol.</li>
		<li>SAMs secos con flujo de nitrógeno para uso directo o almacenarlos en etanol durante un máximo de 4 días para su uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Adquisición de datos
NOTA: Todas las mediciones que se muestran aquí se realizaron en agua ultrapura con un AFM Cypher ES utilizando una etapa de muestra de calentamiento y enfriamiento para la variación de la temperatura. Generalmente, se pueden utilizar todos los AFM que proporcionan la capacidad de medir en líquidos.
<ol><li>Inserte el chip voladizo AFM funcionalen en el AFM.</li>
	<li>Pegue la superficie preparada en un soporte de muestra que sea adecuado para medir en líquidos (por ejemplo, compuesto de replicación de alta resolución 101RF o un adhesivo curable UV). NOTA: Estos agentes de unión son altamente inertes y resistentes a un gran número de disolventes polares. Antes de su uso, se debe comprobar la resistencia del adhesivo a disolventes no polares (p. ej., tolueno o hexano) o a altas temperaturas.</li>
	<li>Sumerja el chip voladizo AFM y la muestra de la sonda en el líquido, aquí: agua ultrapura. NOTA: Se puede depositar una gota de disolvente (alrededor de 100 l) en el soporte de chip voladizo AFM. Cubrir el chip voladizo AFM con disolvente reduce las fuerzas capilares, que de otro modo actuarían en el voladizo AFM al acercarse a la superficie de la muestra pasando a través de la interfaz aire-solvente.</li>
	<li>Si es necesario, ajuste la temperatura y deje que el sistema se equilibre. NOTA: Los cambios de temperatura pueden resultar en una desviación del voladizo AFM debido a un efecto bimetálico para voladizos AFM con un recubrimiento reflectante como aluminio u oro. El equilibrio debe realizarse lejos de la superficie (varios m) hasta que no se observe ningún cambio adicional de la señal de deflexión (hasta 15 min para MLCT-Bio-DC).</li>
	<li>Variar la temperatura aleatoriamente para excluir cualquier efecto del envejecimiento de la funcionalización. Asegúrese de que las temperaturas aplicadas no conduzcan a una flexión irreversible del voladizo AFM. NOTA: Cualquier efecto de temperatura sobre las propiedades del disolvente (como la evaporación o los cambios en la viscosidad) podría obstaculizar sus experimentos. En los ejemplos presentados, la temperatura fue variada en un rango de hasta 40 K en pasos de 10 K tomando agua como disolvente (por ejemplo, de 278 K a 318 K).</li>
	<li>Acérquese a la superficie para determinar el InvOLS (sensibilidad inversa de la palanca óptica) tomando curvas de extensión de fuerza en una superficie dura (como el óxido de silicio). Para ello, tome la señal de desviación del fotodetector (en V) frente a la distancia piezoeléctrica y determine la pendiente de la parte que representa la sangría de la punta del voladizo AFM en la superficie subyacente (régimen repulsivo) utilizando una función lineal. Para reducir los errores, tome el promedio de al menos cinco valores para obtener el valor final de InvOLS. Para más detalles, véase la literatura4,39. NOTA: El InvOLS solo se puede determinar de forma fiable en superficies duras. En el caso de experimentos en superficies o interfaces blandas, asegúrese de colocar una superficie dura cerca de las superficies blandas. A continuación, la calibración de InvOLS se puede realizar antes o después de los experimentos de superficie blanda sin necesidad de desmontar la configuración de AFM.</li>
	<li>Para la determinación constante del resorte, mueva el voladizo AFM a una altura sin interacciones atractivas ni repulsivas entre la punta y la superficie del voladizo AFM (varios m). A continuación, registre un espectro de ruido térmico donde se trace la densidad espectral de potencia (PSD) frente a la frecuencia. Los siguientes pasos se realizan generalmente mediante funciones integradas automatizadas en el software AFM comercial: en primer lugar, el espectro de ruido térmico adquirido se analiza ajustando una función al PSD, por ejemplo, un simple oscilador armónico (SHO). El ajuste se realiza hasta el mínimo entre la primera y la segunda resonancia. En segundo lugar, se determina el área bajo la parte ajustada de la gráfica PSD vs frecuencia que representa el desplazamiento cuadrado medio del voladizo AFM en dirección vertical. Por último, el teorema de equipartición se utiliza para obtener la constante de fuerza de voladizo AFM28,50. NOTA: Se debe utilizar un rango de frecuencia adecuado que comprenda el primer pico de resonancia del voladizo AFM. Para obtener una relación señal-ruido satisfactoria, se deben acumular al menos 10 PSD con la resolución de frecuencia más alta posible.</li>
	<li>Inicie el experimento. Registre los mapas de fuerza tomando curvas de extensión de fuerza de forma similar a una cuadrícula (por ejemplo, 10 x 10 puntos para un área de 20 x 20 m2) para evitar cualquier efecto de superficie local (por ejemplo, impurezas, dislocaciones) y para promediar diferentes superficies. NOTA: Los parámetros típicos son una velocidad de tracción de 1 m/s y una frecuencia de muestreo de 5 kHz para garantizar una resolución suficiente. La velocidad de muestreo debe adaptarse cuando la velocidad de tracción es variada. La distancia de retracción debe adaptarse a la longitud de contorno o desorción del polímero medido (aprox. el doble de la longitud esperada).</li>
	<li>Utilice y varíe el tiempo de permanencia hacia la superficie para permitir que el polímero único se adhiera a la superficie (normalmente 0 – 5 s).</li>
	<li>Repita la determinación del InvOLS y la constante de resorte al final del experimento para comprobar la consistencia y la estabilidad del sistema. NOTA: Para una fuerte adhesión entre el polímero y la superficie, la calibración se puede realizar después del experimento real para preservar la funcionalización.</li>
</ol>6. Evaluación de datos
NOTA: Para la evaluación de datos, se utilizó un software escrito a medida basado en Igor Pro para realizar los siguientes pasos.
<ol><li>Convierta la señal de desviación en bruto (en Voltios) en valores de fuerza (en Newtons) por multiplicación con el InvOLS registrado y la constante de resorte determinada.</li>
	<li>Restar la desviación del voladizo AFM (después de la multiplicación de la señal de desviación en bruto con el InvOLS) de la distancia impulsada por los elementos piezoicos en dirección vertical con el fin de obtener la extensión verdadera (distancia de la superficie de la punta)4.</li>
	<li>Corrija las curvas de extensión de fuerza obtenidas para la deriva ajustando una función lineal a la línea base después del último evento y restando la misma de la curva de extensión de fuerza. La pieza ajustada debe representar una extensión suficiente de la superficie en la que no se observen interacciones atractivas ni repulsivas entre la punta en voladizo AFM y la superficie subyacente. A continuación, la línea base se establece en el eje cero. NOTA: En el caso de mediciones en superficies altamente reflectantes como el oro, pueden aparecer interferencias. Estos son el resultado de la reflexión parcial del rayo láser desde la superficie y desde la parte posterior del voladizo AFM. Por lo tanto, las curvas de extensión de fuerza obtenidas podrían mostrar un artefacto de señal de fuerza sinusoidal a lo largo de la extensión vertical. Este es un artefacto que obstaculiza los valores de fuerza finales. Con el fin de tener en cuenta estas curvas de extensión de fuerza, es posible una corrección (Figura 2).</li>
	<li>Si las interferencias aparecen en las curvas de extensión de fuerza, seleccione una curva de extensión de fuerza representativa (curva de retracción) que no muestre otros eventos que posiblemente un pico de adhesión inespecífico y el mismo artefacto sinusoidal (es decir, amplitud y fase)(Figura 2A). NOTA: Suavizar la curva de fuerza-extensión representativa para obtener el patrón de baja frecuencia de la interferencia.</li>
	<li>Seleccione una curva de extensión de fuerza que se va a corregir(Figura 2B).</li>
	<li>Superponga ambas curvas de extensión de fuerza desde los pasos 6.4. y 6.5. para asegurarse de que ambos muestran el mismo artefacto sinusoidal (es decir, amplitud y fase)(Figura 2C).</li>
	<li>Restar la curva de extensión de fuerza representativa (suavizada) de la curva de fuerza-extensión para corregirla, que conduce a una línea base recta en lugar de una línea base sinusoidal(Figura 2D). NOTA: Tenga cuidado de que el pico de adhesión inespecífico de la curva representativa sea distinto de cualquier evento de molécula única que aparezca en las curvas que deba corregirse. De hecho, la selección de la curva representativa es crucial para una corrección adecuada.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero competidor.

SMFS basado en AFM es una de las principales herramientas para investigar interacciones de moléculas únicas en la física de polímeros. Para un verdadero experimento de molécula única, la unión covalente del polímero de la sonda a una punta en voladizo AFM es esencial.
Muchos trabajos anteriores se basan en experimentos de nanopesca, en particular para PNiPAM, donde los polímeros se adsorban sobre una superficie y luego se estiran recogiéndolos aleatoriamente del sustrato utilizando una punta de voladizo AFM30,31. Esto podría alterar los resultados y conducir a una interpretación errónea del comportamiento de una sola molécula. Allí, los efectos cooperativos pueden dominar los resultados porque no se pueden excluir las interacciones con polímeros vecinos. Esto tiene un gran impacto en los resultados, especialmente para polímeros que muestran un comportamiento significativamente diferente a granel en comparación con moléculas aisladasindividuales 57,58.
El protocolo de funcionalización presentado aquí es fiable y se puede aplicar fácilmente a diferentes polímeros, independientemente de su longitud de contorno, hidrofobicidad o el obstáculo esterico de los monómeros. Además, se proporciona una pasivación para evitar interacciones no deseadas entre el polímero de una sola sonda y la punta en voladizo AFM, así como entre la punta en voladizo AFM y la superficie subyacente. Además, se muestra la evaluación de las curvas de fuerza-extensión que muestran los eventos de estiramiento. Allí, se propone un procedimiento para la determinación de curvas maestras de fuerza-extensión. Esto ofrece un mejor medio de revelar, por ejemplo, efectos relacionados con la temperatura en el comportamiento de la extensión de la fuerza. Además, se proporciona el análisis de eventos de desorción de molécula única con mesetas de fuerza constantes. Además, se da una forma sencilla de corregir artefactos de señal de fuerza sinusoidal en curvas de extensión de fuerza que de otro modo podrían afectar los resultados del experimento.
En comparación con Stetter et al.39, el procedimiento de funcionalización que se presenta aquí se reduce a tres pasos en lugar de cuatro y se mejora la robustez del procedimiento. El principal beneficio de realizar PEGylation y silanization en un solo paso es tener una reacción mejor controlada y aumentar el rendimiento. Además, es necesario preparar menos soluciones y se requieren menos pasos de aclarado. Esto reduce el esfuerzo y el tiempo de preparación y aumenta la reproducibilidad. Además, mover voladizos AFM es siempre una parte crítica del proceso de funcionalización. Una transferencia de una solución a otra siempre corre el riesgo de influir fuertemente en la calidad de la funcionalización debido a las transferencias a través de la interfaz aire-agua o de perder voladizos AFM por el uso inadecuado de pinzas.
Con el fin de demostrar la fijación covalente adecuada de un solo polímero a una punta en voladizo AFM se deben cumplir diferentes condiciones. En primer lugar, los voladizos de control AFM son de importancia significativa y deben estar preparados para cada funcionalización. El proceso de funcionalización y la célula fluida para realizar los experimentos sólo se consideran limpios, si un pequeño número de curvas de extensión de fuerza muestran estiramientos o mesetas en el experimento de control (en los ejemplos presentados menos del 2%).
Un patrón de estiramiento claro sin más gotas o máximas es esencial para tener eventos de estiramiento de una sola molécula adecuados. Además, se debe analizar la dependencia de la fuerza de ruptura de la velocidad de carga de la fuerza en la rotura o la respuesta elástica completa de la curva de estiramiento con el fin de excluir la desorción simultánea de múltiples polímeros59,60. Para PEG y PNiPAM, el 19% y el 42% de las curvas de extensión de fuerza tomadas en diferentes posiciones de la superficie mostraron un patrón de estiramiento, respectivamente. Para obtener eventos de estiramiento, la fisisorción del polímero a la superficie subyacente respectiva debe ser fuerte. De lo contrario, se observa un evento de desorción similar a una meseta. Esto es aún más decisivo para la detección de eventos de estiramiento a altas fuerzas (hasta 500 pN o más). Como esta fuerte fisisorción no se cumple para cada curva de extensión de fuerza, el rendimiento de tales eventos es menor que para eventos de desorción pura como meseta. Como alternativa, se pueden utilizar grupos fuertemente adhering como catecol o quimiosoripción entre el polímero y la superficie subyacente. Sin embargo, esto requiere la introducción de otros grupos funcionales o sitios de acoplamiento en el polímero61,62.
De hecho, la masa (es decir, la longitud del contorno) del polímero proporciona una huella dactilar valiosa. Aunque la masa no se puede traducir directamente a la longitud de contorno medida por las siguientes razones, la distribución de la longitud es muy valiosa para definir eventos de una sola molécula. En el caso de un polímero PNiPAM con una baja polidispersidad(a 1,28), encontramos diferencias significativas en los valores de extensión para los eventos de estiramiento obtenidos (y, por lo tanto, en la longitud del polímero) en los experimentos. Una razón para ello podría ser la determinación de la longitud del polímero y su distribución. En la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), se determina un peso relativo del polímero objetivo en comparación con normas como PS o poli (metacrilato de metilo) (PMMA)63. Se espera que el supuesto peso relativo se desvíe del peso molecular absoluto porque el radio hidrodinámico del polímero objetivo y el estándar pueden diferir significativamente. Además, la capa de silano podría ser oligomerizada por agua espuria en tolueno durante el proceso de funcionalización. La unión de estos oligómeros a la punta en voladizo AFM conduce a una capa más flexible con menos puntos de anclaje64. Además, el punto de unión del polímero a la capa de silicio podría no estar necesariamente en el ápice que conduce a un desplazamiento de los valores de longitud detectados29. Mientras que un modelo de polímero como la cadena de gusano (WLC) o el modelo de cadena libremente articulada (FJC) no puede reproducir el comportamiento de extensión de fuerza respectivo para PEG o PNiPAM correctamente en todo el rango de extensión18,29,41,65,66, tal modelo de polímero podría ser valioso para otros sistemas poliméricos y proteicos10,15,67,68.
La unión covalente de un solo polímero PS (con una longitud de contorno de más de 1 m) sólo se considera exitosa, cuando un número considerable de curvas de extensión de fuerza muestran una meseta lo suficientemente larga de fuerza constante (Figura 5). Una meseta resultante de desorbing un solo polímero se define por una sola caída aguda de una fuerza constante a la línea de base en una cierta extensión, como se indica en la Figura 5A. Si se unen más polímeros a la punta en voladizo AFM, se observa una cascada de mesetas56 (Figura 5C). La longitud de la meseta (longitud de la desorción), que se correlaciona con la longitud del contorno del polímero51,tiene que ser significativamente más larga que cualquier pico de adhesión debido a la adhesión inespecífica de la punta en voladizo AFM a la superficie subyacente (aquí alrededor de 200 nm). Las entidades que aparecen únicamente en una sola curva de extensión de fuerza, no deben interpretarse. En los experimentos presentados, al menos 80 de cada 100 curvas mostraron una meseta de más de 200 nm en al menos dos mapas de fuerza en dos puntos diferentes en la superficie. Además, la distribución de longitudes de desorción, utilizando gráficas de dispersión como las indicadas en las figuras 5B y 5D,revelan si y cuántos polímeros están unidos a la punta en voladizo AFM. En el caso de PS, una distribución estrecha de la fuerza de desorción y la longitud tomada de las mesetas de las curvas de extensión de fuerza sirvió como evidencia de un apego covalente exitoso. Esto finalmente demostró el éxito del protocolo de funcionalización. Por lo tanto, recomendamos encarecidamente presentar tales distribuciones de fuerza y longitud en las publicaciones.
La evaluación de curvas de extensión de fuerza mediante algoritmos integrados que comprenden muchos parámetros predefinidos debe hacerse con cuidado. Las razones son, por ejemplo, que una velocidad de muestreo fija no es adecuada para cada velocidad de tracción aplicada o que un suavizado automatizado de las curvas de extensión de fuerza podría promediar detalles importantes. Por lo general, una comprensión adecuada del procedimiento de evaluación respectivo puede prevenir errores en el procedimiento de evaluación, lo que a su vez puede influir fuertemente en los hallazgos finales de un experimento SMFS basado en AFM.
En resumen, presentamos un protocolo de funcionalización que es fiable y se puede aplicar fácilmente a una variedad de polímeros. Además, se presenta una evaluación adecuada de las curvas de fuerza-extensión de molécula única, lo que permite la determinación de parámetros físicos como la fuerza de estiramiento, la fuerza de desorción y la longitud de la desorción. Los protocolos y procedimientos presentados son valiosos para la investigación de sistemas sensibles a los estímulos a nivel de molécula única.

Desde su invención en la década de 19801, el microscopio de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en una de las técnicas de imagen más importantes en ciencias naturales con resolución espacial subnanómetro, resolución de fuerza subpiconewton y la posibilidad de medir en diversas condiciones de disolvente y temperatura2,,3,4,5,6,7.
Aparte de la imagen8,9, AFM se utiliza para realizar espectroscopía de fuerza de molécula única (SMFS) dando una visión de las interacciones adhesivas entre un solo polímero y superficies, propiedades físicas de polímeros individuales y mecanismos de desdoblamiento de proteínas7,10,11,12,13,14,15,16. En un experimento Regular SMFS, la punta en voladizo funcionalizada entra en contacto con una superficie de modo que el polímero en el voladizo AFM fisisorbes a esta superficie. Al retraer la punta del voladizo AFM de la superficie, un cambio en la desviación del voladizo AFM se convierte en una fuerza que conduce a una curva de extensión de fuerza4. Los parámetros físicos como la fuerza de estiramiento, la fuerza de desorción y la longitud de la desorción pueden determinarse como dependientes de diferentes parámetros como la velocidad de tracción, el tiempo de permanencia en la superficie, la profundidad de la indentación en la superficie, la temperatura, el disolvente17,,18 y diferentes superficies como sustratos sólidos, películas poliméricas o bicapas de lípidos compatibles19,,20,,21,,22. Además, un polímero puede ser sondeado en diferentes direcciones espaciales, investigando así las propiedades de fricción del polímero23,,24,,25,26.
Una unión covalente del polímero investigado a una punta en voladizo AFM es esencial para tales estudios. Así, un alto rendimiento de eventos de molécula única con un mismo polímero unido a una punta en voladizo AFM evita cualquier sesgo de los resultados debido a la calibración de la constante de resorte del voladizo AFM27,28, diferentes puntos de fijación29 o polímeros variables (con diferentes longitudes de contorno) como en el caso de los experimentos de nanopesca30,,31,32. También, las interacciones con otros polímeros, así como los efectos de promediación pueden prevenirse ampliamente18,28. Para la unión covalente de un polímero a la punta en voladizo AFM, se pueden aplicar diferentes tipos de modificaciones químicas, muchas de las cuales se resumen en el libro de Hermanson33. Las reacciones de enlace basadas en aminas y tioles, así como la química de clics, representan los métodos más utilizados en la funcionalización de punta silver AFM34,35,36,37,38,39,40,41,42. 40 muestran cómo utilizar 1-etil-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS química para unir una proteína a una punta en voladizo AFM. Sin embargo, dichos grupos funcionales tienden a cruzar, lo que conduce a una pérdida de funcionalidad43,44. Además, los carbodiimides muestran una tendencia a la hidrólisis rápida en la solución43. Los grupos de maleimida y tiol son generalmente más estables y no muestran reacciones de reticulación. El protocolo presentado es una optimización de los protocolos previamente publicados dados en las referencias35,,39.
Aquí, se presenta un protocolo de funcionalización confiable que se puede ajustar fácilmente a un gran número de polímeros diferentes, independientemente de las propiedades tales como la longitud del contorno o la hidrofobicidad. A modo de ejemplo, se eligieron tres polímeros diferentes: polietilenglicol hidrófilo (PEG) y poli(N-isopropilacrilamida) (PNiPAM), así como poliestireno hidrófobo de masa molar alta (PS). Con el fin de proporcionar una capacidad de unión covalente con una molécula de vinculador adecuada, los tres polímeros fueron seleccionados para presentar una mitad de tiol telechel como grupo final funcional. La molécula del vinculador en sí es típicamente un polímero PEG corto con dos sitios activos, un grupo de silano en un extremo y un grupo de maleimida en el otro extremo. El primero permite un acoplamiento covalente a la punta en voladizo AFM y el segundo una reacción de unión con el grupo tiol del polímero funcionalizado de masa molar alta. Además, las moléculas inactivas del vinculador PEG sirven como una capa de pasivación para evitar interacciones no deseadas entre el polímero de la sonda y la punta del voladizo AFM, así como entre la punta del voladizo AFM y la superficie subyacente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Dodecanethiol (&#8805;98%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>417364-500ML</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution (30%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>CP17.2</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypher ES</td>
			<td>Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>PO76.1</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated silicon wafer</td>
			<td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Replicating Compound</td>
			<td>Microset Products Ltd, UK</td>
			<td>101RF</td>
			<td>Bonding agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Software environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra-30-LF-PC</td>
			<td>Diener Electronic, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Plasma chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane</td>
			<td>Creative PEG works, USA</td>
			<td>PHB-1923</td>
			<td>Linker polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>Bruker, USA</td>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV &#60; 10 &#181;m</td>
			<td>MicroChemicals, Germany</td>
			<td>WSA40600250 P1314SNN1</td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&#937; cm</td>
			<td>Elga LabWater, Germany</td>
			<td>10034-540</td>
			<td>Ultrapure water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R3 SA</td>
			<td>Vomm GmbH, Germany</td>
			<td>5803 Blank</td>
			<td>Tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)</td>
			<td>Gallei Group, Saarland University, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>PNiPAM probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated polystyrene</td>
			<td>Polymer Source, Canada</td>
			<td>P40722-SSH</td>
			<td>PS probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol-polyethylene glycol-thiol</td>
			<td>Creative PEGWorks, USA</td>
			<td>PSB-615</td>
			<td>PEG probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene (99.99%)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>T324-500</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy

La espectroscopia de fuerza de molécula única basada en microscopía de fuerza atómica (AFM) es una herramienta ideal para investigar las interacciones entre un solo polímero y superficies. Para un verdadero experimento de molécula única, la unión covalente de la molécula de sonda es esencial porque sólo entonces se pueden obtener cientos de trazas de extensión de fuerza con una misma molécula única. Muchos rastros son a su vez necesarios para demostrar que una sola molécula es sondeada. Además, la pasivación es crucial para prevenir interacciones no deseadas entre la molécula de sonda única y la punta en voladizo AFM, así como entre la punta del voladizo AFM y la superficie subyacente. El protocolo de funcionalización presentado aquí es fiable y se puede aplicar fácilmente a una variedad de polímeros. Los eventos característicos de una sola molécula (es decir, estiramientos y mesetas) se detectan en las trazas de extensión de fuerza. A partir de estos eventos, se pueden obtener parámetros físicos como la fuerza de estiramiento, la fuerza de desorción y la longitud de desorción. Esto es particularmente importante para la investigación precisa de sistemas sensibles a los estímulos a nivel de molécula única. Como sistemas ejemplares poly(etilenglicol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) y poliestireno (PS) se estiran y desorbidan de SiOx (para PEG y PNiPAM) y de superficies monocapa autoensambladas hidrofóbicas (para PS) en ambienteacuso.

Los siguientes ejemplos muestran resultados de estiramiento y desorción de molécula única de los polímeros PEG, PNiPAM y PS. Todas las puntas en voladizo AFM se funcionaron con el protocolo indicado anteriormente. PEG y PNiPAM se midieron en SiOx con variación de temperatura. Para una discusión detallada de las curvas de estiramiento dependientes de la temperatura resultantes para PEG y PNiPAM, véase Kolberg et al.18 Un motivo de extensión de fuerza diferente es una meseta de fuerza constante (por ejemplo, cuando desorta PS de monocapas autoensambladas de algos terminados de metilo en oro (SAM) en agua4,27,39,51).
Ejemplo 1: Estiramiento de PEG y PNiPAM en agua El comportamiento de estiramiento dependiente de la temperatura en el agua se midió utilizando polímeros PNiPAM y PEG unidos covalentemente a una punta en voladizo AFM en un extremo y fisisorbiados en una superficie de SiOx en el otro extremo. Después de los experimentos de calibración y control limpio (menos del 2% de las curvas de extensión de fuerza muestran eventos de molécula única), se registraron al menos dos mapas de fuerza para cada voladizo AFM. El experimento dependiente de la temperatura se realizó registrando al menos un mapa de fuerza a cada temperatura. Cuando sólo aparecieron pocos eventos de estiramiento, el voladizo AFM respectivo fue descartado y se tomó el siguiente voladizo AFM del chip (generalmente en el orden C, B, D y E de MLCT-Bio-DC). Para los datos ejemplares de PEG, se observó un único evento de estiramiento en 95 de 500 curvas de extensión de fuerza medidas (19%). Para PNiPAM, 252 de 600 curvas de extensión de fuerza mostraron un patrón de estiramiento (42%). Para una mejor comparación de las curvas de extensión de fuerza, se generó una sola curva maestra para cada temperatura. Para ello, sólo se eligieron las curvas con un evento de estiramiento a al menos 500 pN, donde las fluctuaciones de conformación y los efectos solventes son insignificantes, se eligieron52. El número final de tramos tomados en cuenta fue de 3 a 278 K, 7 a 298 K y 4 a 318 K para PEG y 4 a 278 K, 3 a 298 K y 3 a 318 K para PNiPAM18.
El procedimiento para generar curvas maestras se indica en la Figura 3. Las curvas de extensión de fuerza elegidas(Figura 3A) se redimensionan a una longitud L0 (extensión a una fuerza de 500 pN), véase la Figura 3B. El pico de adhesión muestra una gran variación de adhesión inespecífica entre la superficie y la punta en voladizo AFM, pero no influye en el comportamiento de estiramiento del polímero. Después de fusionar las curvas de extensión de fuerza reescalado, se promedian mediante un suavizado binominal como se presenta en la Figura 3C. Para ello, un filtro gaussiano confunde los datos con coeficientes normalizados derivados del triángulo de Pascal a un nivel igual al parámetro de suavizado 2053. Por último, se obtiene una curva maestra para cada temperatura como se indica en la Figura 3D. El zoom muestra el rango donde el efecto de temperatura en el comportamiento de la extensión de fuerza es más pronunciado.
En la Figura 4se puede encontrar una comparación del comportamiento de temperatura de PEG (A) y PNiPAM (B). Para PEG se observó una disminución de la fuerza de estiramiento con el aumento de la temperatura. Se observó un aumento de aproximadamente el 5% de la extensión redimensionada a 100 pN al aumentar la temperatura de 278 a 318 K. Para PNiPAM, se podría revelar un cambio opuesto dependiente de la temperatura. Además, se observó una disminución de aproximadamente el 1% de la extensión redimensionada a 100 pN cuando la temperatura se incrementó de 278 a 328 K. Además, la energía libre de estiramiento se podía obtener de las curvas maestras de extensión de fuerza determinando el área bajo la curva para cualquier valor de fuerza dado. Esto podría ser utilizado para extraer contribuciones energéticas y entrópicas de la energía libre de estiramiento con la ayuda de simulaciones de dinámica molecular (MD)18.
Ejemplo 2: Desorción de PS de una superficie SAM en el agua La desorción de PS de una superficie SAM en el agua podría utilizarse para determinar la fuerza y longitud de desorción y así cuantificar la interacción hidrofóbica. Después de la calibración, se registraron al menos dos mapas de fuerza en dos puntos diferentes de la superficie. Cuando el accesorio de polímero tuvo éxito, las curvas de extensión de fuerza mostraron mesetas de fuerza constante, como característica característica, véase la Figura 5A y la Figura 5C. La desorción similar a la meseta se observa cuando la dinámica de los bonos sonprodos es mucho más rápida que la tasa de tracción de la punta del voladizo AFM (cuasi-equilibrio). Las fuerzas de desorción de las curvas de fuerza-extensión similares a la meseta proporcionan directamente energías libres de adhesión mediante la integración de la traza de extensión de fuerza54. Se han utilizado para determinar las interacciones electrostáticas, dispersivas e hidrofóbicas, así como las propiedades de fricción de polímeros individuales en superficies en ambiente líquido2,4,23,51,54,55.
Cada meseta de fuerza constante fue equipada con una curva sigmoidal para determinar la fuerza de desorción y la longitud de desorción, que luego se trazaron en histogramas. Los histogramas fueron equipados con un gaussiano para extraer el valor máximo y la desviación estándar. Para una mejor visión general, los valores de fuerza de desorción y longitud se mostraron juntos en una gráfica de dispersión, como se indica en la Figura 5B y la Figura 5D.
Para el poliestireno en SAM en agua, las fuerzas de desorción determinadas corresponden a los valores obtenidos previamente19,23. A medida que la longitud de desorción se correlaciona con la longitud de contorno del polímero51,la distribución de la longitud de desorción se puede utilizar como prueba de la unión covalente del polímero respectivo a la punta del voladizo AFM a través de su grupo final funcional. Por lo tanto, la longitud de la desorción sirve como una huella digital.
Para más de un polímero unido a la punta en voladizo AFM, se pueden observar cascadas de mesetas (pasos discretos) en las curvas de extensión de fuerza56. Cada meseta representa la desorción de un polímero en una extensión diferente. El experimento dado en la Figura 5C y la Figura 5D mostró un caso típico de dos polímeros unidos a la punta del voladizo AFM al mismo tiempo. Al ajustar la ruptura final, se pudo encontrar una distribución bimodal para la longitud de la desorción, mientras que la fuerza de desorción mostró una distribución estrecha. En este caso, la longitud de desorción más pequeña se puede encontrar en el 90% de las curvas de extensión de fuerza, ya sea como una sola meseta o como una meseta adicional en la meseta más larga, como se indica en la Figura 5C. La mayor longitud de desorción se encontró en el 37% de las curvas de extensión de fuerza obtenidas. Por lo tanto, la distribución de la longitud de desorción podría utilizarse para determinar el número de polímeros diferentes unidos a la punta en voladizo AFM. En general, una distribución estrecha de los valores de longitud de desorción es una buena indicación de que uno y el mismo polímero único fueron sondeados en las curvas de extensión de fuerza obtenidas. Al mismo tiempo, se puede utilizar una superposición de la respectiva extensión de fuerzas para decidir si se ha medido un mismo polímero.
Después de probar la unión covalente de un solo polímero PS, se pueden realizar más experimentos con este polímero PS de sustrato variable (superficie sólida, así como películas de polímeros), condiciones de disolvente, temperatura, velocidad de tracción o tiempo de permanencia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg"> Figura 1: Visión general esquemática del proceso de funcionalización de la punta. Incluye la modificación química de la punta en voladizo AFM después de (1) activación plasmática (2) silanización/PEGylation y (3) accesorio de polímero. Además, se muestran las estructuras químicas detalladas de los polímeros utilizados, a saber, PEG, PNiPAM y PS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg"> Figura 2: Eliminación de interferencias en curvas de extensión de fuerza. (A) Encontrar una curva de extensión de fuerza que muestre un artefacto de señal de fuerza sinusoidal a lo largo de la extensión pero no tiene un solo evento de estiramiento de molécula. (B) Elija una curva de extensión de fuerza con un solo evento de molécula, que debe corregirse a partir del artefacto sinusoidal. (C) Superponer las curvas para controlar si los artefactos sinusoidales de las curvas realmente coinciden. (D) Restando la curva de extensión de fuerza (A) de (B) se obtiene una curva de extensión de fuerza con una línea base recta. Aunque el pico de adhesión no se puede utilizar para un análisis posterior, la curva de extensión de fuerza ahora se corrige para el artefacto que conduce a valores de fuerza mucho más precisos en la región del evento de molécula única (aquí: > 0,2 m de extensión). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg"> Figura 3: Determinación de curvas maestras a partir de curvas de extensión de fuerza de PEG a 298 K. (A) Datos experimentales a 298 K, utilizando 7 curvas de extensión de fuerza. Después de reescalar a una longitud L0 a una fuerza de 500 pN(B),las curvas de extensión de fuerza se pueden fusionar y promediar mediante suavizado binominal obteniendo una curva maestra (C). Las curvas redimensionadas se dan como puntos, mientras que la curva maestra se muestra como una línea sólida. Por último, se pueden comparar las curvas maestras obtenidas para diferentes temperaturas (D). El zoom indica el rango donde el efecto de temperatura en el comportamiento de la extensión de fuerza es más pronunciado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg"> Figura 4: Comparación de las curvas maestras dependientes de la temperatura de PNiPAM y PEG. Para PEG se observa un aumento de la extensión redimensionada a 100 pN (rango de fuerza media) al aumentar la temperatura (A), mientras que para PNiPAM se revela un desplazamiento opuesto dependiente de la temperatura (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg"> Figura 5: Análisis de las curvas de extensión de fuerza de PS en SAM en agua. (A) Curva de extensión de fuerza ejemplar (azul) con un ajuste sigmoidal de la meseta (púrpura). Además, las flechas marcan la fuerza determinada (rojo) y la longitud (verde) de la meseta. Los valores de fuerza de desorción y longitud de desorción obtenidos por ajustes sigmoidales se muestran en una gráfica de dispersión y los histogramas resultantes están equipados con un gaussiano. (B) Los valores de fuerza media de desorción y longitud de desorción determinados son (112 x 6) pN y (659 x 7) nm, en los que el 93 % de las curvas de extensión de fuerza muestran tales eventos de meseta única. (C) Curva de extensión de fuerza ejemplar (azul) para dos polímeros unidos a la punta del voladizo AFM al mismo tiempo. En este caso, la fuerza de desorción muestra una distribución unimodal con un valor de fuerza medio de (117 x 5) pN, mientras que se puede encontrar una distribución bimodal para la longitud de desorción que conduce a valores de longitud media de (656 a 9) nm y (1050 a 16) nm. (D) el 90% de las curvas de extensión de fuerza muestreadas solo muestran eventos de meseta única. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

La unión covalente de moléculas de sonda a puntas voladizas de la microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica esencial para la investigación de sus propiedades físicas. Esto nos permite determinar la fuerza de estiramiento, la fuerza de desorción y la longitud de los polímeros a través de la espectroscopia de fuerza de molécula única basada en AFM con alta reproducibilidad.

Adjunto covalente de moléculas únicas para espectroscopia de fuerza basada en AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

La espectroscopia de fuerza de molécula única nos permite medir parámetros físicos que describen las propiedades mecánicas y adhesivas de los polímeros. Cuando se utiliza espectroscopia de fuerza basada en AFM para estudiar moléculas individuales, es esencial tener un protocolo confiable y eficiente para unir estas moléculas covalentemente a una punta voladizo AFM. Este protocolo se puede adoptar a muchos polímeros diferentes independientemente de la longitud del contorno o la hidrofobicidad.Todos los pasos deben llevarse a cabo en una campana de humo para evitar la inhalación de vapores orgánicos. Además, se requiere vidrio resistente a disolventes, capa de laboratorio y protección ocular. Primero use pinzas recién limpiadas para colocar virutas en voladizo AFM en la cámara de plasma.Inicie el programa de activación de la superficie de la cámara de plasma seleccionando inicio y luego sí. Compruebe que el proceso de plasma funciona correctamente. Un proceso de plasma con un alto contenido de oxígeno muestra un color azul claro.Mientras se ejecuta el programa de activación de la superficie, disolver silane-PEG-mal en tolueno para obtener una concentración de 1,25 miligramos por mililitro. Coloque tres mililitros de la solución en un plato plano de Petri. Una vez completado el proceso de plasma, ventile la cámara de plasma seleccionando confirmar y luego ventilando.Proceda inmediatamente al siguiente paso para evitar la absorción de contaminantes. Coloque las fichas en el plato Petri e incubar las fichas durante tres horas a 60 grados centígrados. Retire el plato Petri del horno y deje que se enfríe durante al menos 10 minutos.A continuación, enjuague las fichas. Para la unión a PEG o poliestireno, enjuague las virutas con tolueno tres veces. Para la unión a polinipam, las virutas se deben enjuagar una vez con tolueno y dos veces con etanol.Para reducir el impacto de las fuerzas capilares en el voladizo AFM, incline ligeramente las virutas al enjuagar. Las virutas en voladizo AFM deben enjuagarse correctamente para eliminar cualquier exceso de polímeros físicos que pueda influir en el experimento. El enjuague debe realizarse cuidadosamente para evitar cualquier daño a los voladizos AFM.Por último, prepare al menos dos virutas para servir como controles que no serán objeto de fijación de polímero covalente. Para los controles frente a las virutas de PEG y poliestireno, enjuague dos veces con etanol y una vez con agua. Para los controles frente a las virutas de poliníptico, enjuague dos veces con agua.Para realizar la unión covalente de PEG o poliestireno, preparar tres mililitros de solución polimérica en tolueno a una concentración de 1,25 miligramos por mililitro. Agregue la solución y las virutas a un plato de Petri e incubar las virutas a 60 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación con PEG o poliestireno, deje que las virutas se enfríen durante 10 minutos.Enjuague las virutas dos veces con tolueno, dos veces con etanol y una vez con agua. Para realizar la unión covalente de polinipam, preparar tres mililitros de solución polimérica en etanol a una concentración de 1,25 miligramos por mililitro. Agregue la solución y las virutas a un plato de Petri e incubar las virutas a temperatura ambiente durante tres horas.Después de la incubación con polinipam, enjuague las virutas dos veces con etanol y dos veces con agua. Para almacenar las virutas hasta que se usen en un experimento, coloque cada chip por separado en un plato petri de un mililitro lleno de agua. Mantenga los platos de Petri a cuatro grados centígrados.En primer lugar, inserte el chip voladizo AFM funcionalizado en un soporte de viruta. Pegue la superficie preparada en un soporte de muestra adecuado para mediciones en líquido. Utilice una pipeta para sumergir el chip en agua.Monte la superficie de la muestra en el AFM. Sumerja la superficie de la muestra en agua. Conecte el soporte de chip al AFM.A continuación, acerque el chip a la superficie de la muestra. Utilice el panel ambiental para ajustar la temperatura objetivo y cambiar el modo y los botones de opción de retroalimentación. A continuación, deje que el sistema se equilibre durante unos 15 minutos.Para tomar una curva de extensión de fuerza, acérquese a la punta volual AFM a la superficie y seleccione una sola fuerza. La curva resultante muestra la desviación contra la distancia piezoeléctrica con el acercamiento a la superficie mostrado en rojo y la retracción mostrada en azul. Expanda la parte de la curva que representa la sangría de la punta voladiza AFM en la superficie subyacente.Para realizar un ajuste lineal, establezca los cursores en el enfoque o en la curva de retracción y seleccione actualizar INVOLS en el menú contextual. El valor resultante para el valor de sensibilidad de la palanca óptica inversa aparece en el panel en la parte superior izquierda. Después de repetir este procedimiento al menos cinco veces, calcule un promedio para la sensibilidad inversa de la palanca óptica e introduzca el promedio en el panel.Coloque el voladizo AFM a una altura de aproximadamente 100 micrómetros por encima de la superficie seleccionando mover para preenganche. Para obtener una relación señal-ruido satisfactoria para el espectro de ruido térmico, establezca el recuento de promedio en al menos 10 y elija la resolución de frecuencia más alta posible. A continuación, registre el espectro de ruido térmico seleccionando capturar datos térmicos.Para ajustar el espectro de ruido térmico con una función de oscilador armónico simple, expanda la parte de la curva que representa el primer pico de resonancia. A continuación, seleccione initialize fit. Por último, refinar el ajuste mediante el botón de ajustar datos térmicos.La constante de fuerza respectiva aparecerá en el panel. Para comenzar a recopilar los datos, establezca los parámetros para el experimento. Ajuste la velocidad de tracción a un micrómetro por segundo y el gatillo de fuerza a un nanonewton.Acérquese a la punta del voladizo AFM a la superficie y seleccione una sola fuerza para registrar una sola curva y determinar si los parámetros deben ajustarse como se describe en el manuscrito. Seleccione Mapa F en el panel maestro. Para obtener un mapa de fuerza con 100 curvas, establezca el número de puntos de fuerza y las líneas de fuerza en 10.Comience a grabar el mapa de fuerza seleccionando hacer el mapa F. Tome curvas de extensión de fuerza de forma similar a una cuadrícula para evitar efectos de superficie locales y para promediar diferentes áreas de superficie. Después del experimento, repita la determinación de la sensibilidad inversa de la palanca óptica y la constante del muelle para comprobar la consistencia y la estabilidad del sistema.Los polímeros de polinipam único y PEG se unieron covalentemente a una punta voladiza AFM en un extremo y se fisisorbieron en la superficie de dióxido de silicio en el otro extremo. Para medir el comportamiento de estiramiento dependiente de la temperatura, se identificó un evento de estiramiento claro de una sola molécula seguido de un máximo final al final de la curva de extensión de fuerza respectiva. A continuación, se generó una sola curva maestra para cada temperatura.Para PEG, se observó una disminución de la fuerza de estiramiento con el aumento de la temperatura. Para el polinipam, se observó la tendencia opuesta. La desorción de poliestireno de una superficie SAM en agua se puede utilizar para determinar la fuerza y longitud de desorción.Cuando el accesorio de polímero tuvo éxito, las curvas de extensión de fuerza mostraron mesetas de fuerza constante. Cada meseta estaba equipada con una curva sigmoideal para determinar la fuerza de desorción y la longitud de desorción. Las fuerzas de desorción observadas correspondían a valores obtenidos previamente.Cuando se observó más de un polímero unido a la punta del voladizo AFM, se observaron cascadas de mesetas en las curvas de extensión de fuerza. Con dos polímeros unidos, se encontró una distribución bimodal para la longitud de desorción, mientras que la fuerza de desorción mostró una distribución estrecha. Una punta voladiza AFM funcionalizada se puede utilizar para cuantificar la respuesta de fuerza de moléculas individuales en un entorno líquido y con estímulos externos.El uso de equipos limpios, disolventes, puntas en voladizo AFM y enjuague repetido es muy importante para alcanzar un alto nivel de limpieza que debe confirmarse antes de los experimentos controlados descritos. Los protocolos y procedimientos presentados allanaron el camino para una mejor comprensión de los sistemas de polímeros sensibles a los estímulos. Los resultados se pueden comparar directamente con las simulaciones dinámicas moleculares.

Adjunto covalente de moléculas únicas para espectroscopia de fuerza basada en AFM

Abstract