Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

L'analisi sperimentale delle cellule che si dividono in tessuti e organi vivi e intatti è essenziale per la nostra comprensione di come la divisione cellulare si integra con lo sviluppo, l'omeostasi dei tessuti e i processi della malattia. Gli spermatociti di Drosophila sottoposti a meiosi sono ideali per questa analisi perché (1) testiti di Drosophila interi contenenti spermatociti sono relativamente facili da preparare per la microscopia, (2) le grandi dimensioni degli spermatociti li rendono adatti per l'imaging ad alta risoluzione e (3) potenti strumenti genetici della Drosophila possono essere integrati con l'analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo facilmente accessibile per la preparazione di interi testicoli da Drosophila terza larve instar e pupe prime. Descriviamo come identificare gli spermatociti meiotici in teste interi preparati e come immaginerli dal vivo per microscopia time-lapse. Vengono inoltre forniti protocolli per la fissazione e l'immunostaining dei teste interi. L'uso di testicoli larvali ha diversi vantaggi rispetto ai protocolli disponibili che utilizzano testicoli adulti per l'analisi dello spermatocite. Ancora più importante, i testicoli larvali sono più piccoli e meno affollati di cellule rispetto ai testicoli adulti, e questo facilita notevolmente l'imaging ad alta risoluzione degli spermatociti. Per dimostrare questi vantaggi e le applicazioni dei protocolli, presentiamo risultati che mostrano la ridistribuzione del reticolo endoplasmico rispetto ai microtubuli del mandrino durante la divisione cellulare in un unico spermatocito immagine di microscopia confocale time-lapse. I protocolli possono essere combinati con l'espressione di qualsiasi numero di proteine fluorescenti o marcatori di orgelli, così come mutazioni genetiche e altri strumenti genetici, rendendo questo approccio particolarmente potente per l'analisi dei meccanismi di divisione cellulare nel contesto fisiologico di interi tessuti e organi.