Vi vil gerne anerkende UF-ICBR proteomics facilitet for deres behandling af vores prøver. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (CAP).

Den institutionelle Animal Care and Use Udvalg fra University of Florida godkendt alle dyreforsøg.
1. Klargøring af reagenser
<ol><li>Klargør CHAPS Lysis Buffer (150 mM KCl, 50 mM HEPES pH = 7,4, 0,1% CHAPS og 1 proteasehæmmercocktailtablet pr. 50 ml buffer). Buffer uden proteasehæmmere kan opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder eller buffer med proteasehæmmer opbevaret ved -20 °C op til 1 år.</li>
	<li>Forbered 100 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB): Tilsæt 500 μL 1 M TEAB til 4,5 ml ultrarent vand.</li>
	<li>Der fremstilles 200 mM tris (2-carboxyethyl) fosforhydrochlorid (TCEP): Der tilsættes 70 μL 0,5 M TCEP, et denaturerende reagens, til 70 μL ultrarent vand. Derefter tilsættes 35 μL af 1 M TEAB.</li>
	<li>5% hydroxylamin: Tilsæt 50 μL 50% hydroxylamin til 450 μL 100 mM TEAB.</li>
</ol>2. Proteinekstraktion
<ol><li>Isoler quadriceps muskel fra en aflivet mus i henhold til en IACUC godkendt protokol. Frys og vedligehold ved -80 °C eller fortsætte med protokollen til øjeblikkelig brug.</li>
	<li>Skæres til at isolere ca 10 mg frisk eller frossen quadriceps musevæv. Separate fibre ved hjælp af en pincet, når du arbejder med skeletmuskulatur. Alternativt, hvis der arbejdes med cellekulturer, resuspend ~3 x 106 celler i 300 μL CHAPS lysis buffer og springe til trin 2.4.</li>
	<li>Homogenisere væv ved hjælp af en perle forstyrrer ved hjælp af 2 ml rør fyldt med ca 200 μL af 1 mm zirkonia / silica perler og 500 μL CHAPS lysis buffer. Skaler op eller ned efter behov (f.eks. 5 mg væv i 250 μL CHAPS lysis buffer).</li>
	<li>Udfør sonikering (10x for 10 s hver med 50% amplitude og 30 s intervaller på is) for at frigive protein bundet til DNA. De samme DNA-nedbrydningsresultater kan opnås enten med sprøjtelyse ved at føre lysatet 10x gennem en 21 G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte eller ved benzonaseinkubation (44 U/ml) ved 37 °C i 30 min.</li>
	<li>Lysatremet centrifugeres ved 16.000 x g i 10 min ved 4 °C, og supernatanten overføres til et nyt centrifugerør.</li>
</ol>3. Proteinmåling
<ol><li>Bestemme proteinkoncentrationen af supernatanten ved hjælp af etablerede protokoller (se Tabel over Materialer). BEMÆRK: Det er bedst at anvende prøver ved ≥2 μg/μL, men der kan også anvendes mindre koncentrerede prøver. Hvis der anvendes en mindre koncentreret prøve, vil det være nødvendigt at justere mængden af reduktions-/alkylerende reagenser i trin 5.1 på passende vis.</li>
	<li>Forbered en BSA-standardkurvefortynding ved hjælp af CHAPS lysis buffer.</li>
	<li>Følg producentens anvisninger, og efter 15 min. læses absorbansen ved 750 nm.</li>
</ol>4. Reduktion/alkylning reagensbehandling
<ol><li>200 μg protein pr. tilstand overføres til et nyt centrifugerør, og der justeres til et endeligt volumen på 100 μL ved hjælp af CHAPS lysis buffer. Det er muligt at skalere op til 200 μL, når proteinkoncentrationen er for lav, men glem ikke at justere mængden af reducerende/alkylerende reagens.</li>
	<li>Der tilsættes 5 μL af de 200 mM TCEP og inkuberes prøver ved 55 °C i 1 h.</li>
	<li>Umiddelbart før brug fremstilles 375 mM iodoacetamid ved at opløse et rør iodoacetamid (dvs. 9 mg) i 132 μL 100 mM TEAB. Beskyt denne opløsning mod lys.</li>
	<li>Der tilsættes 5 μL 375 mM iodoacetamid til prøven og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (RT), der er beskyttet mod lys.</li>
</ol>5. Methanol/chloroform udfældning20
<ol><li>Der tilsættes 400 μL methanol til hver 100 μL protein og kortvarigt vortex-prøver.</li>
	<li>Centrifuge ved 9.000 x g for 10 s ved RT. Dette skal indeholde væsker, der er deponeret på siderne af prøveglasset.</li>
	<li>Der tilsættes 100 μL chloroform til blandingen og kortvarig vortex. Der anvendes 200 μL chloroform, hvis prøven har en høj koncentration af fosfolipider.</li>
	<li>Centrifuge ved 9.000 x g for 10 s ved RT. Dette skal indeholde væsker, der er deponeret på siderne af prøveglasset.</li>
	<li>Tilsæt 300 μL vand og vortex kraftigt. Det er vigtigt at opnå en homogen opløsning.</li>
	<li>Centrifuge ved 9.000 x g i 1 min ved RT. Vær yderst omhyggelig med at undgå at forstyrre lagene, når du overfører røret til et stativ. BEMÆRK: Røret skal nu indeholde tre faser: 1) Toplag (dvs. supernatant), en blanding af vand og methanol; 2) Mellemlag (dvs. interfase), hvidt udfældt protein; og 3) Bundlag (dvs. nederste fase), chloroform.</li>
	<li>Fjern forsigtigt supernatanten.</li>
	<li>Der tilsættes 300 μL methanol til den resterende mellemfase- og bundfase. Vortex kraftigt.</li>
	<li>Centrifuge ved 9.000 x g i 2 min ved RT. Vær yderst omhyggelig med at undgå at forstyrre lagene, når du overfører røret til et stativ.</li>
	<li>Fjern forsigtigt supernatanten.</li>
	<li>Forsigtigt aspirere så meget væske som muligt under en strøm af luft (f.eks ved hjælp af en vakuum koncentrator) på RT, indtil pellet er bare en smule fugtig (~ 10 min). Da den nødvendige tid kan være forskellig for hver prøve, skal du kontrollere hver 2 min. for at vurdere. Pellet opbevares ved -80 °C indtil videre forarbejdning.</li>
</ol>6. Proteinfordøjelse
<ol><li>Opslæmmet den udfældede proteinpille i 100 μL TEAB lysis buffer. BEMÆRK: Det er valgfrit at måle proteinkoncentrationen på dette trin.</li>
	<li>Umiddelbart før brug fremstilles 1 μg/μL trypsin ved at tilsætte 100 μL af trypsinopbevaringsopløsningen (50 mM eddikesyre) til bunden af hætteglasset med 100 μg trypsinglas og inkuberes i 5 min ved RT. Opbevares resterende reagens i engangsdoser ved -80 °C.</li>
	<li>Der tilsættes 2,5 μL trypsin pr. 100 μg protein. Prøven fordøjes natten over ved 37 °C. Dette trin er afgørende for fuldstændig opløselighed af proteinet; ikke ændre disse betingelser. Efter fordøjelsen er det valgfrit at måle proteinkoncentrationen ved hjælp af standardproteinanalyser.</li>
</ol>7. Peptid mærkning
<ol><li>Umiddelbart før brug skal TMT-etiketsættets reagenser bringes i jævn til RT.</li>
	<li>Hvert af 0,8 mg TMT-mærkehætteglassene opløses ved tilsætning af 41 μL vandfri acetonitril til hvert rør. Reagenset inkuberes i 5 minutter ved RT med lejlighedsvis vortexing. Kort centrifugere rørene. BEMÆRK: En koncentration på 0,8 mg TMT-tag er normalt nok til at mærke to sæt. Andre efterforskere har imidlertid påvist, at denne koncentration kan reduceres yderligere, og at de stadig giver pålidelige data15.</li>
	<li>Der tilsættes forsigtigt 41 μL af REAGEnset på TMT-mærket til hver 100 μL prøve.</li>
	<li>Inkuber reaktionen i 1 time ved RT.</li>
	<li>Der tilsættes 8 μL 5% hydroxylamin til prøven og inkuberes i 15 min for at slukke reaktionen.</li>
	<li>Prøverne opdeles i lige store mængder i et nyt centrifugerør, og opbevares ved -80 °C. BEMÆRK: I dette trin er prøverne stabile og kan indsendes til massespektroskopi. Det er valgfrit at måle koncentrationen på dette punkt ved hjælp af standardproteinanalyser.</li>
</ol>8. Massespektroskopi
<ol><li>Prøverne indsendes til et proteomics-anlæg (denne undersøgelse anvendte UF ICBR Proteomics Core-anlægget), hvor alle prøver kombineres og renses ved hjælp af C18-spinkolonner. BEMÆRK: Diskuter med kernen facilitet, hvordan du indsender prøverne før forberedelse dem til at bekræfte de nøjagtige trin, de foretrækker for indlæg.</li>
	<li>Anmod om følgende procedurer pr. kombineret multiplexprøve: fast faseekstraktion, HPLC (SCX, SE), zip tip og LC-MS/MS (2 timers gradient for protein-id, hvis >10QE Plus).</li>
	<li>Når dataene er indsamlet, vil kernefaciliteten behandle RAW-filer ved hjælp af leverandør-leveret software til proteinidentifikation.</li>
</ol>9. Dataanalyse
<ol><li>Data leveres typisk fra kernen tilbage til brugeren i 7z-formatet, hvilket kan kræve ca. 16 GB diskplads pr. datasæt (i dette tilfælde 11 prøver). Til databehandling skal du kontrollere, at der findes en computer, der er mindst 3,4 GHz.</li>
	<li>Udpak filer ved hjælp af 7-Zip File Manager. Disse udpakkede filer indeholder RAW-data, pdStudy-formatfil og pdResultView-formatfil. Gem alle filer til yderligere analyser.</li>
	<li>Åbn fil ved hjælp af Proteome Discovery 2.2 Software. BEMÆRK: Filformatet er "File name.pdStudy". Hvis "File name.pdResultView" åbnes, er det ikke muligt at vælge kontrolelementeksemplet.</li>
	<li>Vælg kontroleksempler på panelet "Prøver".</li>
	<li>Åbn Resultat ved at vælge ID i panelet "Analyseresultater".</li>
	<li>Eksporter til regnearkssoftware.</li>
	<li>Gem rådata (alle identificerede proteiner).</li>
	<li>Åbn regnearkssoftwarefilen. Dette vil indeholde alle proteiner, der er blevet identificeret.</li>
	<li>I regnearkssoftwarefilen skal du bruge funktionen "Filter" til at screene "Protein FDR Confidence: Combined" i høj (kolonne B), "#Unique peptider" højere end 2 (kolonne K), og enten en af "Abundance Ratio" blank udelukkende ( kolonneS op til W).</li>
	<li>Indsætte en kolonne til "p-værdi" beregning med funktionen =TTEST(kontrolgruppe,forsøgsgruppe, haler, type)</li>
	<li>Indsætte en kolonne for "Statistisk signifikans" med funktionen =HVIS(p-værdi<0,05, "Signifikans","NS")</li>
	<li>Brug funktionen "Filter" til at screene "Statistisk signifikans", der viser "Signifikans". Resultatet viser de analyserede proteiner med den statistiske signifikans i kontrolgruppen og forsøgsgruppen.</li>
	<li>Bestemme signifikant højere eller lavere proteinudtrykstæthed i forsøgsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen, indsætte en kolonne for "Regulering" med funktionen =HVIS(MIDDEL(kontrolgruppe)>MIDDEL(forsøgsgruppe),"Upregulated","Nedreguleret")</li>
</ol>10. Metoder til evaluering af signifikante hits
<ol><li>For at identificere protein-protein interaktioner mellem de signifikante hits identificeret i TMT undersøgelser, skal du bruge Search Tool for hentning af interagerende gener / proteiner (STRING) version 11,021: <a href="https://string-db.org/" target="_blank">https://string-db.org/</a>
</li>
	<li>At klassificere efter grupper (dvs. molekylær funktion, biologiske processer, og protein klasser) bruge Protein Analysis gennem Evolutionary Relationships (PANTHER) ontologi klassificering software22: <a href="http://www.pantherdb.org/" target="_blank">http://www.pantherdb.org/</a>
</li>
	<li>Brug vejanalysesoftware23til at identificere proteininteraktioner på en række forskellige veje.</li>
</ol>11. Proteomisk dataoverførsel til en lagerbank
<ol><li>At sende proteomiske data til Proteomics IDEntificantions Database (PRIDE) eller Mass Spectromery Interactive Virtual Environment (MassIVE) omfatter følgende oplysninger: toplistefilerne (behandlede massespektrumfiler i et standardformat som f.eks. mzXML, mzML eller MGF), resultatfiler (frekvensidentifikationer i et standardformat som mzIdentML eller mzTab) og råspektrumfiler (rå massespektrumfiler i et ikke-standard- eller instrumentspecifikt format, f.eks. RAW-filer eller . wiff-filer).</li>
	<li>Hvis du vil sende, skal du oprette en konto og medtage oplysninger som f.eks. Vælg derefter de filer, der er angivet i trin 11.1, og overfør dem.</li>
	<li>Hvis du vil oprette et officielt datasæt, skal du køre en indsendelsesarbejdsproces på disse uploadede filer. BEMÆRK: Efter indsendelse vil datasættet være privat i lagerbanken. Med den private mulighed er dataene kun tilgængelige for autoriserede brugere. Der er to yderligere muligheder: 1) Delt datasæt, som giver adgang til journalanmeldere og samarbejdspartnere; eller 2) Offentligt datasæt, som vises i offentlige datasætsøgninger. Et andet vigtigt element i disse lagre er muligheden for at opdatere de uploadede data og knytte efterfølgende publikationer til det eksisterende datasæt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Graves, P. R., Haystead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biologist's+guide+to+proteomics.">Molecular biologist's guide to proteomics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).</li><li>Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Relative+Quantitation+of+Proteins+Using+Tandem+Mass+Tags+(TMT)+and+Mass+Spectrometry+(MS).">Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS).</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li><li>Rabilloud, T., Lelong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+a+tutorial.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial.</a> Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Anderson, N. G., Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+two-dimensional+electrophoresis:+Past,+present+and+future.">Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future.</a> Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).</li><li>Haynes, P. A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiling-pitfalls+and+progress.">Proteome profiling-pitfalls and progress.</a> Yeast. 17 (2), 81-87 (2000).</li><li>Bunai, K., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+limitation+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+in+bacterial+membrane+protein+proteomics+and+perspectives.">Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).</li><li>Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILAC+fly+allows+for+accurate+protein+quantification+in+vivo.">The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).</li><li>Zhang, G., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC)+for+phosphotyrosine+protein+identification+and+quantitation.">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC-based+quantitative+MS+approach+for+real-time+recording+protein-mediated+cell-cell+interactions.">SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8441 (2018).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+Mass+Tags:+A+Novel+Quantification+Strategy+for+Comparative+Analysis+of+Complex+Protein+Mixtures+by+MS/MS.">Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Labeling+Using+Isobaric+Tagging+Reagents+for+Quantitative+Phosphoproteomics.">Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).</li><li>Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+Tandem+Mass+Tag+(SL-TMT)+Protocol:+An+Efficient+Strategy+for+Quantitative+(Phospho)proteome+Profiling+Using+Tandem+Mass+Tag-Synchronous+Precursor+Selection-MS3.">Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3.</a> Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+Labeling+for+the+Masses:+A+Robust+and+Cost-efficient,+In-solution+Labeling+Approach.">TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+Design+of+New+Isobaric+Labeling+Reagents+for+Quantitative+Proteomics.">Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics.</a> Molecules. 24 (4), E701 (2019).</li><li>Suzuki-Hatano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9-TAZ+Gene+Replacement+Ameliorates+Cardiac+TMT+Proteomic+Profiles+in+a+Mouse+Model+of+Barth+Syndrome.">AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 13, 167-179 (2019).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1954 (2010).</li><li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass-spectrometry-based+Proteomics+Analysis+of+Ocular+Microvessels.">Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59140 (2019).</li><li>Wessel, D., Fl&#252;gge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).</li><li>Jensen, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING+8--a+global+view+on+proteins+and+their+functional+interactions+in+630+organisms.">STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms.</a> Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Pathway-Based+Analysis+Tools+That+Visualize+Genetic+Variants.">A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants.</a> Frontiers in Genetics. 8, 174 (2017).</li><li>Plaxton, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Proteolysis+during+the+Extraction+and+Purification+of+Active+Plant+Enzymes.">Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).</li><li>Ryan, B. J., Henehan, G. T., Walls, D., Loughran, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Chromatography: Methods and Protocols. , 53-69 (2017).</li><li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis.">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

For at kunne forberede prøver til proteomisk analyse ved hjælp af TMT-baserede isoobaric stabile isotop mærkning metoder, er det afgørende at udføre protein ekstraktioner meget omhyggeligt ved 4 °C og at bruge en lysis buffer, der indeholder en proteasehæmmer cocktail24,25. Proteasehæmmercocktailen er et afgørende reagens for at undgå uventet proteinforringelse under proteinfordøjelse. En væsentlig forskel mellem vores protokol og den nuværende, som sælgeren leverer, er, at vi på det kraftigste anbefaler brugen af CHAPS lysis buffer baseret på vores erfaring med pattedyrceller og væv. Vi foreslår også at bruge en methanol / chloroform protein udfældning tilgang til både celle pellets og væv.
Ideelt set udføres proteinekstraktion, måling, reduktion/alkylerende reagensbehandling og methanol/chloroformfældning alle samme dag. Efter denne anbefaling vil resultere i mere nøjagtige proteinkoncentrationer for efterfølgende mærkning. Proteinudfældningstrinnet er vigtigt for fjernelse af reagenser, der vil forstyrre tandemmassespektrometri. Hvis du medtager udfældningen, øges opløsningen af TMT26betydeligt . Alt i alt er de største fordele ved vores TMT-protokol de høje mærkningseffektiviteter for forskellige typer prøver, dens reproducerbarhed og de pålidelige data, der er erhvervet.
Som multiplex karakter af denne TMT umålrettede proteomics strategi fortsætter med at udvide, vil det gradvist øge forskernes evne på tværs af en bred vifte af områder til at gøre nye opdagelser. Specifikt på det biomedicinske område, vi og andre har fundet denne teknologi i stigende grad informativ i undersøgelser udforske nye mekanismer for handling i sygdom og relative virkninger af forskellige terapeutiske. Af alle disse grunde supplerer denne kraftfulde teknologi repertoiret af andre OMICS-tilgange, der anvendes i moderne forskningsundersøgelser, og giver vigtige oplysninger, der kan være retningsgivende for yderligere terapeutisk udvikling.

Udtrykket "proteomics" blev først defineret som den store karakterisering af hele proteintiltet af en celle, væv eller organisme1. Proteomiske analyser gør det muligt at undersøge mekanismer og cellulære processer, der er involveret i sygdomsudvikling, terapeutiske veje og sunde systemer ved hjælp af teknikker til at udføre relativ kvantificering af proteinudtryksniveau2. De første beskrivelser af sådanne undersøgelser blev offentliggjort i 1975 og viste , at der anvendes todimensional polyacrylamide gelelektroforese (2D-PAGE) til dette formål1,3. 2D-metoden adskiller proteiner baseret på ladning (isoelektrisk fokusering, IEF) og molekylær masse (natriumdodecylsulfat polyacrylamide gel elektroforese, eller SDS-PAGE)4. I årevis var kombinationen af 2D-PAGE og efterfølgende tandemmassespektrometri udført på hver gelkomponent den mest almindelige ikke-målrettede proteinekspressionsanalyseteknik, der blev udført og identificeret adskillige hidtil ukendte proteinekspressionsprofiler5,6. Generelle ulemper ved 2D-SIDE-metoden er, at den er tidskrævende, ikke fungerer godt for hydrofobe proteiner, og der er begrænsninger i det samlede antal proteiner, der vurderes på grund af lav følsomhed7,8.
Den stabile isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) blev den næste populære metode til at identificere og kvantificere proteintæthed i prøver9. Den består af metabolisk mærkning af celler, der inkuberes i medium mangler en standard essentiel aminosyre og suppleret med en isotop-mærket version af denne specifikke aminosyre10. Fordelen ved denne teknik er dens effektivitet og præcise mærkning9. Den væsentligste begrænsning af SILAC-metoden er primært den reducerede cellevækstrate forårsaget af isotopmærkeintegrering, som kan være særligt udfordrende i relativt følsomme cellelinjer, der modellerer sygdomme hos mennesker11.
I 2003, en ny og robust proteomics teknik, der involverer tandem masse tag (TMT) isobaric etiketter blev introduceret til feltet12. TMT-mærkning er en kraftfuld metode på grund af dens øgede følsomhed til at detektere relative proteinudtryksniveauer og posttranslationelle modifikationer13. Fra denne udgivelsesdato er der udviklet TMT-sæt, der samtidig kan mærke 6, 10, 11 eller 16 prøver. Som følge heraf er det muligt at måle peptidtætheden under flere forhold med biologiske replikater på samme tid14,15,16. Vi har for nylig brugt TMT til at karakterisere hjerte proteomisk profil af en musemodel af Barth Syndrom (BTHS)17. Dermed var vi i stand til at påvise udbredt forbedring i hjerteprofiler af BTHS mus behandlet med genterapi og identificere nye proteiner påvirket af BTHS, der afslørede nye terapeutiske veje involveret i kardiomyopatier.
Her beskriver vi en detaljeret metode til at udføre multiplex TMT kvantitative proteomics analyser ved hjælp af vævsprøver eller cellepiller. Det kan være gavnligt at udføre prøvepræparatet og mærkningen, før de underkastes en kerne, fordi de mærkede tryptiske peptider er mere stabile end rå frosne prøver, ikke alle kerner har erfaring med håndtering af alle prøvetyper, og forberedelse af prøver i et laboratorium kan spare tid for kerner, som ofte har lange efterslæb. For detaljerede beskrivelser af massespektroskopi del af denne proces henvises til Kirshenbaum et al. og Perumal et al.18,19.
Prøveforberedelsesprotokollen består af følgende vigtige trin: ekstraktion, kvantificering, udfældning, fordøjelse og mærkning. De største fordele ved denne optimerede protokol er, at den reducerer omkostningerne ved mærkning, forbedrer proteinekstraktion og konsekvent genererer data af høj kvalitet. Derudover beskriver vi, hvordan man analyserer TMT-data for at screene tusindvis af proteiner på kort tid. Vi håber, at denne protokol tilskynder andre forskningsgrupper til at overveje at indarbejde denne effektive metode i deres undersøgelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90114</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Hydroxylamine, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51101</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonaze nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23209</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28300</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR analog</td>
			<td>12621-104</td>
			<td>Equipment for protein digestion incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RDD002</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90058</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46436</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Plate reader for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23275</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23290</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OPTON-30945</td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90110</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT11-131C Label Reagent 5 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A34807</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51140</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis

Proteomiske teknologier er kraftfulde metoder, der kan hjælpe vores forståelse af virkningsmekanismer i biologiske systemer ved at give et globalt overblik over virkningen af en sygdom, behandling eller anden tilstand på proteome som helhed. Denne rapport indeholder en detaljeret protokol for ekstraktion, kvantificering, udfældning, fordøjelse, mærkning og efterfølgende dataanalyse af proteinprøver. Vores optimerede TMT-mærkningsprotokol kræver en lavere tag-label-koncentration og opnår konsekvent pålidelige data. Vi har brugt denne protokol til at evaluere proteinudtryksprofiler i en række forskellige musevæv (dvs. hjerte, skeletmuskulatur og hjerne) samt celler dyrkede in vitro. Derudover demonstrerer vi, hvordan man evaluerer tusindvis af proteiner fra det resulterende datasæt.

Sunde og syge celler blev lyset i CHAPS buffer, udarbejdet som beskrevet i vores TMT mærkning metode, og forelagt University of Florida Tværfaglige Center for Bioteknologi Forskning (UF-ICBR) Proteomics Core for Flydende kromatografi med tandem masse spektrometri. Efter dataindsamling og levering fra kernen blev datasættet åbnet i software leveret af leverandører, og følgende cutoff-filtre blev anvendt: ≥2 unikke peptider, reporterioner for hver proteinprøve, der findes i alle kanaler, og omfatter kun signifikant ændrede proteiner (p ≤ 0,05). Tabel 1 opsummerer dataene: 39.653 peptider i alt, hvoraf 7.211 har samme eller større end to unikke peptider, og 3.829 omfatter reporterioner for alle kanaler. P-værdierne for disse 3.829 peptider blev beregnet ved Students t-test, og p ≤ 0,05 blev anset for signifikant. Desuden blev der anvendt en sammenstregning af sammenstregning til at bestemme den relative fordeling af proteiner fra syge sammenlignet med raske celler: nedreguleret (blå) eller upregulateret (rød) (figur 1).
Listen over signifikant dysregulateret proteinudtryk blev vurderet ved hjælp af PANTHER ontology klassifikationssystemet og STRING-analyser. Panther analyser viste en kategoriseret liste over proteiner baseret på betydeligt lavere (Figur 2A) eller højere overflod i syge celler baseret på molekylær funktion (Figur 2B). Strenganalyser af proteiner med betydeligt lavere (Figur 2C) og højere (Figur 2D) overflod identificerede flere interaktioner og stærke associationer mellem proteiner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig1.jpg"> Figur 1: Volcano plot viser proteiner, hvis overflod ikke var væsentligt ændret (sort), betydeligt sænket (blå), eller betydeligt øget (rød) i syge vs sunde kontrolceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig2.jpg"> Figur 2: Repræsentative evalueringer af signifikant dysregulerede hits identificeret ved PANTHER (A, B) og String (C, D) af signifikant lavere eller højere forekomst proteiner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptider i alt</td>
			<td>Identificeret i alt</td>
			<td>≥ 2 unikke peptider</td>
			<td>Kvantificerede proteiner</td>
			<td colspan="2">Væsentligt ændrede proteiner</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lav</td>
			<td>Høj</td>
		</tr>
<tr>
<td>39653</td>
			<td>7211</td>
			<td>4457</td>
			<td>3829</td>
			<td>296</td>
			<td>108</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Repræsentativ tabel over kvantificerede proteiner pr. analyse af datasæt.

Watch this Scientific Journal Video about TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis at JoVE.com

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Vi præsenterer en optimeret tandem masse tag (TMT) mærkning protokol, der indeholder detaljerede oplysninger for hvert af følgende trin: protein udvinding, kvantificering, nedbør, fordøjelse, mærkning, indsendelse til en proteomics facilitet, og dataanalyser.

TMT Prøve forberedelse til Proteomics Facility Indsendelse og efterfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

De største fordele ved denne protokol er, at det reducerer omkostningerne ved mærkning, forbedrer proteinudvinding, og genererer data af høj kvalitet. De største fordele ved vores protokol er de høje mærkningseffektiviteter for de forskellige typer prøver, dens reproducerbarhed og den pålidelige dataindsamling. Efter isolering quadriceps muskelvæv prøver fra en aflivet mus i henhold til en IACUC godkendt protokol, afveje 10 milligram muskelvæv og bruge pincet til at adskille muskelfibre.For at skabe et lysat overføres den separerede vævsprøve til et to milliliterrør indeholdende 200 mikroliter af en millimeter zirconia silicaperler og 500 mikroliter CHAPS lysis buffer. Prøverne sættes i en perleforstyrrende og udfør to sekventielle 45-sekunders kørsler. Efter den anden cyklus, at frigive DNA-bundet protein, sonikere prøven 10 gange i 10 sekunder pr sonikering på en 50% amplitude med 30-sekunders intervaller på is.Efter den sidste sonikering centrifuges lysatet og overfør supernatanten til et nyt centrifugerør. Til reduktion/alkylerende reagensbehandling overføres 200 mikrogram protein pr. tilstand til nye centrifugerør, og der anvendes frisk CHAPS lysis-buffer til at bringe det endelige volumen i hvert rør op på 100 mikroliter. Dernæst tilsættes fem mikroliter af TCEP til hvert rør og inkubere prøverne ved 55 grader Celsius i en time.Ved inkubationens afslutning opløses ni mg iodoacetamid i 132 mikroliter på 100 millimolar TEAB, og den resulterende 375 millimolar iodoacetamidopløsning beskyttes mod lys. Derefter tilsættes fem mikroliter iodoacetamid til hver prøve og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys. Ved methanol/kloroformfældning tilsættes der 400 mikroliter methanol til hver 100 mikroliter protein, og prøverne skal anvendes kortvarigt.For at inkorporere de væsker, der er deponeret på siderne af prøverørene, skal prøverne kort centrifuges, og der tilsættes 100 mikroklitter chloroform til hvert rør. Efter en kort vortexing, hurtigt centrifuge rørene igen for at indsamle væsken på siderne af rørene og tilsæt 300 mikroliter vand til prøverne. Vortex kraftigt at opnå homogene opløsninger og centrifuge prøverne i et minut under de samme centrifuge betingelser.I slutningen af centrifugen overføres rørene forsigtigt til et stativ uden at forstyrre lagene og forsigtigt fjerne supernatanten. Der tilsættes 300 mikroliter methanol til de resterende inter- og bundfaser, og prøvne hvirvles kraftigt igen. Centrifuge prøverne i to minutter og forsigtigt aspirere supernatanter.Derefter forsigtigt aspirere så meget væske fra hver prøve som muligt under en strøm af luft, indtil pellets er bare en smule fugtig. Vurder hydreringen hvert andet minut i ca. 10 minutter. Hvis det er nødvendigt, kan pellets opbevares på minus 80 grader Celsius indtil videre behandling.For at fordøje proteinet skal du genbruge den udfældede pellet i 100 mikroliter TEAB lysis buffer og tilsættes 100 mikroliter trypsin opbevaringsopløsning til bunden af et 100 mikrogram trypsinglasglas. Efter fem minutter ved stuetemperatur tilsættes 2,5 mikroliter af den frisklavede trypsinopløsning pr. 100 mikrogram protein til hver prøve og inkubere prøverne ved 37 grader Celsius natten over. For peptid mærkning, opløses hver 0,8 milligram TMT tag hætteglas med 41 mikroliter af vandfri acetonitrile per tag og inkubere reagenserne i fem minutter ved stuetemperatur med lejlighedsvis vortexing og samtidig holde etiketterne beskyttet mod lys.Ved inkubationens afslutning centrifugeres hætteglassene kortvarigt, og der tilsættes omhyggeligt 41 mikroliter TMT-etiketreage til hver 100 mikroliterprøve for en times inkubation ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen slukkes reaktionerne med tilsætning af otte mikroliter på 5% hydroxylamin i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter opdeles prøverne i lige aliquots i nye centrifugerør til opbevaring ved minus 80 grader Celsius.I denne repræsentative dataindsamling, 39, 653 samlede peptider blev analyseret, hvoraf 4, 457 havde lige eller større end to unikke peptider og 3, 829 inkluderet reporter ioner for alle kanaler. En fold ændring cutoff blev brugt til at bestemme den relative fordeling af proteiner fra syge sammenlignet med raske celler med 296 proteiner af betydeligt lavere overflod og 108 proteiner af betydeligt højere forekomst observeret. PANTHER analyse viste en kategoriseret liste over proteiner baseret på betydeligt lavere eller højere forekomst af syge celler baseret på deres molekylære funktion.Strenganalyse af proteiner af betydeligt lavere eller højere tæthed yderligere identificeret flere interaktioner og stærke sammenhænge mellem proteiner. Der kan udføres yderligere metoder til at identificere protein-til-protein interaktioner, for at klassificere interaktionerne efter grupper og for at identificere interaktionerne i en række forskellige veje. Proteomics teknikker er kraftfulde værktøjer inden for biomedicinsk forskning områder for at forstå mekanismerne i sygdomsudvikling ved at give detaljerede protein overflod oplysninger.

TMT Prøve forberedelse til Proteomics Facility Indsendelse og efterfølgende dataanalyse

Abstract