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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Présenté ici est un protocole pour évaluer les propriétés contractiles des myofibrils musculaires striés avec la résolution nano-Newton. Le protocole utilise une configuration avec une sonde de force optique basée sur l’interférométrie. Cette configuration génère des données avec un rapport signal/bruit élevé et permet d’évaluer la cinétique contractile des myofibrils.

Résumé

Les cellules musculaires striées sont indispensables à l’activité des humains et des animaux. Les fibres musculaires simples sont composées de myofibrils, qui se composent de sarcomeres liés en série, les plus petites unités contractiles dans le muscle. Le dysfonctionnement sarcomérique contribue à la faiblesse musculaire chez les patients présentant des mutations dans les gènes encodage pour les protéines sarcomériques. L’étude de la mécanique du myofibril permet l’évaluation des interactions actin-myosine sans effets confusionnels potentiels des myofibrils endommagés et adjacents lors de la mesure de la contractilité des fibres musculaires simples. Les dommages ultrastructuraux et le désalignement des myofibrils pourraient contribuer à une contractilité altérée. Si des dommages structurels sont présents dans les myofibrils, ils se brisent probablement pendant la procédure d’isolement ou pendant l’expérience. En outre, les études sur les myofibrils fournissent l’évaluation des interactions actin-myosine en présence des contraintes géométriques des sarcomeres. Par exemple, les mesures dans les myofibrils peuvent élucider si le dysfonctionnement myofibrillaire est l’effet primaire d’une mutation dans une protéine sarcomérique. En outre, la perfusion avec des solutions de calcium ou des composés est presque instantanée en raison du petit diamètre du myofibril. Cela rend les myofibrils éminemment appropriés pour mesurer les taux d’activation et de relaxation pendant la production de force. Le protocole décrit dans cet article utilise une sonde de force optique basée sur le principe d’un interféromètre Fabry-Pérot capable de mesurer les forces de la gamme nano-Newton, couplée à un moteur de longueur piézo et à un système de perfusion à pas rapide. Cette configuration permet l’étude de la mécanique myofibril avec des mesures de force à haute résolution.

Introduction

Les cellules musculaires striées sont indispensables pour les activités de la vie quotidienne. Le mouvement des membres, la fonction respiratoire et le mouvement de pompage du cœur reposent sur la force générée par les cellules musculaires. Le muscle squelettique se compose de fascicles musculaires contenant des faisceaux de fibres musculaires simples (Figure 1A). Ces fibres musculaires sont composées de myofibrils, qui sont formés par des sarcomeres liés en série (Figure 1B,D). Les sarcomeres contiennent des filaments minces et épais. Celles-ci se composent principalement de chaînes de moléc....

Protocole

Le protocole pour l’obtention de biopsies humaines a été approuvé par la commission d’examen institutionnel du Vu University Medical Center (#2014/396) et le consentement écrit en connaissance de cause a été obtenu à partir des sujets. Le protocole d’obtention de biopsies musculaires animales a été approuvé par le comité local d’éthique animale de l’Université VU (AVD114002016501)

1. Préparation et isolement myofibril

REMARQUE : Utilisez des méthodes précédemment décrites pour les biopsies de glycérinate, préparez les différentes solutions de concentration de calcium (pCa)7,

Résultats

Les traces de données ont été enregistrées et ouvertes avec le logiciel de contrôleur système (voir tableau des matériaux). Des traces complètes ou des segments sélectionnés ont été exportés vers le presse-papiers ou le fichier texte pour une analyse plus approfondie avec un logiciel souhaité. Les valves pour contrôler le flux des différentes solutions ont été commutées avec un logiciel personnalisé ou manuellement. Un script MATLAB personnalisé a été utilisé pour analyser les tau.......

Discussion

Décrit est un protocole pour évaluer la fonction contractile des myofibrils isolés des tissus humains ou animaux de muscle squelettique. La résolution de force de cette configuration a déjà été décrite par Chavan et al.12. En bref, il est déterminé par les fluctuations aléatoires de la longueur de la cavité Fabry-Pérot formée entre la fibre de détection et le porte-à-faux, qui produisent la partie dominante du bruit à la sortie de la lecture (exprimée en V) qui, multipliée par .......

Déclarations de divulgation

Michiel Helmes est actionnaire et copropriétaire d’IONOptix Inc.

Remerciements

Ce projet a été financé par l’AFM-Téléthon et une fondation building strength for Nemaline Myopathies. Les auteurs souhaitent reconnaître le créateur des produits mentionnés dans cet article, IONOptix Inc.

....

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Bio Spec Products, Inc.985370-XLTo isolate myofibrils
Custom codedMatlab
Custom fabricatedIncludes Labview program to control over serial connection; To control valves
Custom fabricatedTo cool the Peltier module
Custom fabricated
Custom fabricatedAluminum tissue chamber
Custom fabricatedTo control the valves; Includes PC software to control over USB
IonOptixSystem controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step
IonOptixMCS100To record sarcomere length
IonOptixIncludes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher
IonOptixForce probe
KoolanceADT-EX004S
KoolanceEX2-755To cool the Peltier module
MicrosoftData registration
OlympusIX71
OlympusTH4-200
Sigma-Aldrich529265Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue
Sigma-Aldrich78471Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue
TE Technology, Inc.TE-63-1.0-1.3To cool the tissue flow chamber
TE Technology, Inc.TC-720Includes PC software to control over USB
Tecan Trading AG20736652
Tecan Trading AG20739263Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber
Thermo scientific2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)DiscontinuedAlternative: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)TG150-4To perfuse the tissue
1 PC for IonWizard and 1 PC for other software

Références

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
  2. Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forc....

Réimpressions et Autorisations

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