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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Abstract

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune do sistema nervoso central (SNC) causada pela combinação de fatores ambientais e histórico genético suscetível. Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo típico de doença de MS amplamente utilizado para investigar a patogênese na qual linfócitos T específicos para antígenos de mielina iniciam uma reação inflamatória no SNC. É muito importante avaliar como os linfócitos do SNC regulam o desenvolvimento da doença. No entanto, a abordagem para medir a quantidade e a qualidade dos linfócitos infiltrados no SNC é muito limitada devido às dificuldades em isolar e detectar linfócitos infiltrados do cérebro. Este manuscrito apresenta um protocolo para que seja útil para o isolamento, identificação e caracterização de linfócitos infiltrados do CNS e será útil para nossa compreensão de como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune CNS.

Introduction

Como doença desmielinizante crônica do SNC, a ESM afeta cerca de 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo e carece de tratamentos curativos1. Também é considerada uma doença autoimune, na qual linfócitos T específicos de mielina iniciam uma reação inflamatória e levam à desmielinização e lesão axila no CNS2. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) tem sido amplamente utilizada para investigar mecanismos patogênicos da ESM como um modelo clássico de doença desmielinização autoimune no CNS3. Existem duas maneiras de induzir o EAE: uma é induzir o EAE ativamente imunizando animais com componente....

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo comitê animal da Escola de Ciências Médicas Básicas da Universidade de Xangai Jiao Tong.

1. Preparação dos materiais

  1. Use a sequência MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK de MOG35-55 para obter o peptídeo liofilizado de fontes comerciais. Certifique-se de que a pureza do peptídeo é >95%. Prepare a solução de estoque MOG de 10 mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e armazene a -20 °C.
  2. Prepare uma solução d.......

Representative Results

Após a imunização de camundongos C57BL/6, todos os camundongos foram pesados, examinados e classificados diariamente para sinais neurológicos. O curso clínico representativo da EAE deve resultar em uma curva da doença como apresentado na Figura 2A e uma mudança de peso corporal no camundongo como apresentado na Figura 2B. Os camundongos C57BL/6 imunizados com MOG35-55 geralmente começaram a desenvolver sintomas da doença por volta do dia 10-12 e atingir.......

Discussion

Este estudo apresenta um protocolo para induzir e monitorar a EAE usando MOG35-55 em camundongos C57BL/6, que são considerados um modelo animal experimental neuroimunológico típico de MS. EAE pode ser induzido variando as cepas de camundongos ou o tipo de proteína usada para indução de acordo com a finalidade do estudo. Por exemplo, o uso de peptídeos PLP139-151 em camundongos SJL pode induzir um curso de doença EAE que é especialmente adequado para avaliar efeitos terapêuticos em recaídas15<.......

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31570921 a ZJ, 81571533 para LS), Comissão Municipal de Saúde de Xangai e Planejamento Familiar (201540206 a ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 para ZJ).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2eBioscience56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc blockBioLegend101302
APC anti-mouse IFN-geBioscience17-7311-82
BD LSRFortessa X-20BD
Dounce homogenizerWheaton353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)eBioscience00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer SeteBioscience88-8824-00
FITC anti-mouse CD3BioLegend100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)Sigma-AldrichF5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscienceeBioscience56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 RaDifco Laboratories231141
PE anti-mouse IL-17AeBioscience12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4BioLegend100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400617
PercollGE17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11bBioLegend101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400631
pertussis toxin (PTX)Sigma-AldrichP-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscienceeBioscience17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscienceeBioscience12-4321-80
Rat MOG35–55 peptidesBiosynth InternationalMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

References

  1. Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
  2. Gold, R., Linington, C., Lassmann, H.

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