Изоляция, трансфекция и долгосрочная культура взрослых мышей и крысиных кардиомиоцитов

Ex vivo культуры взрослых млекопитающих кардиомиоцитов (CMs) представляет собой наиболее релевантную экспериментальную систему для in vitro исследования сердечной биологии. Взрослые млекопитающие СМ являются неизлечимо дифференцированными клетками с минимальной пролиферативной емкостью. Постмитотическое состояние взрослых CMs не только ограничивает прогрессирование цикла сердечно-миоцитов клеток, но и ограничивает эффективную культуру CMs. Кроме того, долгосрочная культура взрослых CMs необходима для многих исследований, таких как распространение СМ и анализ экспрессии генов.

Мышь и крыса являются двумя наиболее предпочтительными лабораторных животных, которые будут использоваться для кардиомиоцитов изоляции. В то время как долгосрочная культура крысЫ CMs возможно, взрослые мыши CMs восприимчивы к смерти и не могут быть культурно более пяти дней в нормальных условиях. Таким образом, существует критическая необходимость оптимизации изоляции клеток и долгосрочного протокола культуры для взрослых murine CMs. С помощью этого измененного протокола, можно успешно изолировать и культуры как взрослых мыши и крысы CMs в течение более 20 дней. Кроме того, эффективность трансфекции siRNA изолированных СМ значительно возросла по сравнению с предыдущими докладами. Для изоляции мышей-мышей метод перфузии Langendorff используется с оптимальным ферментным раствором и достаточным временем для полной внеклеточной диссоциации матрицы. Для того, чтобы получить чистые желудочковые CMs, как atria были вскрыты и отброшены, прежде чем приступить к разъединению и покрытие. Клетки рассеивались на пластине с ламинином покрытием, что позволяло эффективно и быстро вложения. CMs было разрешено согласиться на 4-6 ч до siRNA трансфекции. Культурные средства массовой информации обновлялись каждые 24 ч в течение 20 дней, а затем, CMs были зафиксированы и окрашены для сердечно-специфических маркеров, таких как Troponin и маркеры клеточного цикла, такие как KI67.