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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Presentato qui è un protocollo per scoprire i geni del pilota sovraespressi che mantengono le cellule staminali tumorali stabilite derivate dalle cellule del colon-retto HT29. È stato eseguito RNAseq con bioinformatica disponibile per studiare e vagliare le reti di espressione genica per chiarire un potenziale meccanismo coinvolto nella sopravvivenza delle cellule tumorali mirate.

Abstract

Le cellule staminali tumorali svolgono un ruolo vitale contro le terapie cliniche, contribuendo alla ricaduta del tumore. Ci sono molti oncogeni coinvolti nella tumorigenesi e l'avvio delle proprietà dello stelo del cancro. Poiché l'espressione genica nella formazione delle sfere tumorali derivate dal cancro colorettale non è chiara, ci vuole tempo per scoprire i meccanismi che lavorano su un gene alla volta. Questo studio dimostra un metodo per scoprire rapidamente i geni del conducente coinvolti nella sopravvivenza delle cellule staminali del cancro colorettale in vitro. Le cellule tumorali del coloretalizzatore HT29 che esprimono il LGR5 quando coltivate come sferoidi e accompagnano un aumento dei marcatori di stelo CD133 sono state selezionate e utilizzate in questo studio. Il protocollo presentato viene utilizzato per eseguire RNAaseq con bioinformatica disponibile per scoprire rapidamente i geni del pilota sovraespressi nella formazione di sfere tutolali di tipo stelo derivato dall'HT29. La metodologia è in grado di vagliare e scoprire rapidamente potenziali geni del conducente in altri modelli di malattia.

Introduction

Il cancro colorettale (CRC) è una delle principali cause di morte con un'elevata prevalenza e mortalità in tutto il mondo1,2. A causa di mutazioni genetiche e amplificazioni, le cellule tumorali crescono senza controllo proliferativo, che contribuisce alla sopravvivenza cellulare3, anti-apoptosi4e stesità del cancro5,6,7. All'interno di un tessuto tumorale, l'eterogeneità tumorale permette alle cellule tumorali di adattarsi e sopravvivere durante i trattamenti terapeutic....

Protocol

1. Coltura cellulare e formazione della sfera della tumore

  1. Coltura cellule HT29 in un piatto da 10 cm contenente il mezzo aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico penicillina-streptomicina (P/S).
  2. Coltiva le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e il 95% di umidità in condizioni aptiche, fino a raggiungere l'80% di confluenza.
  3. Provare le celle HT29 con 1 mL di 0,25% trypsin per 5 min a 37 s c e di conseguenz.......

Representative Results

Per stabilire il modello per studiare il meccanismo nelle cellule staminali tumorali, le cellule del colon-retto HT29 sono state utilizzate per colture le sfere tumorali simili a stelo del cancro in vitro in una piastra a basso attaccamento contenente B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Le sfere tumorali > 100 m di diametro si sono formate in 7 giorni (Figura 1A). Le sfere tumorali sono state provate in singole cellule e analizzate usando la citometria di flusso per rilevare l'espressione LGR5 e CD13.......

Discussion

In questo studio, le tumori del cancro coltivato sono state utilizzate come modello nell'analisi dei dati degli RNA con la bioinformatica disponibile. Per un modello di malattia, sono state utilizzate sfere tumorali derivate dall'HT29. Poiché le sfere tumorali hanno resistenza ai farmaci contro le terapie tumorali, il modello stabilito può essere utilizzato per studiare i meccanismi dettagliati della resistenza studiando le differenze nell'espressione genica. Inoltre, la tecnologia genomica che utilizza l'RNAseq con la.......

Disclosures

Gli autori non hanno informazioni finanziarie rilevanti.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, per il supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni del Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1J0321), del Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) e del Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 e MMH-106-61). Gli organismi finanziatori non hanno avuto alcuna influenza nella progettazione dello studio e nella raccolta, analisi e interpretazione dei dati o nella scrittura del manoscritto.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
iRiS Digital Cell Imaging SystemLogos Biosystems, IncI10999for observing the formation of tumorspheres
Flow cytometryBD biosciencesFACSCaliburfor detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres
anti-LGR5-PEBiolegend373803LGR5 detection reagent
anti-CD133-PEBiolegend372803CD133 detection reagent
EGFGenScriptZ00333for culture of tumorspheres
bFGFGenScriptZ03116for culture of tumorspheres
HGFGenScriptZ03229for culture of tumorspheres
IL6GenScriptZ03034for culture of tumorspheres
PureLink RNA extraction kitInvitrogen12183025isolate total RNA for RNAseq analysis
RNAseq performanceBiotools, TaiwanRNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalystInstitute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canadahttp://www.networkanalyst.ca/
PrismGraphPad Softwarea statistical analysis software

References

  1. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
  2. Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J.

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