Gli autori ringraziano il Dr. Miguel Spuch-Calvar per lo schema di cocultura nella Figura 3 e alla Dott.ssa Bedia Begum Karakocak per la lettura critica. Questo studio è stato sostenuto dal progetto PATROLS, dal programma orizzonte 2020 dell'Unione europea per la ricerca e l'innovazione in base all'accordo n. 760813, e dalla Fondazione Adolphe Merkle. B.D. ringrazia la fondazione Peter und Traudl Engelhorn per il sostegno finanziario.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La produzione emergente di nuovi materiali, tra cui sostanze chimiche e farmaci, aumenta gradualmente la necessità di modelli in vitro predittivi. Per conformarsi ai tre principi di sostituzione, riduzione e perfezionamento della sperimentazioneanimale 32, i modelli cellulari in vitro sono diventati potenti strumenti per quanto riguarda l'aspetto di sostituzione e riduzione per chiarire i meccanismi di azione di un farmaco o del materiale8,9,10,11. Presentato qui è un protocollo dettagliato di assemblaggio del modello multicellulare utilizzando cellule immunitarie che sono o appena isolate o scongelate da monociti precedentemente congelati. Viene descritta anche la coltivazione del modello in ALI. Infine, il protocollo illustra un esempio di esposizione agli stimoli proinfiammatori e confronta la risposta dei due modelli contenenti monociti freschi o congelati.
Sono stati eseguiti vari studi per confermare e giustificare il valore aggiunto della maggiore complessità dei modelli coltivati ed esposti in condizioni ALI rispetto all'esposizione convenzionale sommersa7,22,31. L'osservazione della maggiore risposta proinfiammatoria nelle coculture rispetto alle monocolture delle cellule epiteliali conferma uno studio precedente. Lo studio ha utilizzato il modello di cocoltura presentato (stimolato con LPS) e ha mostrato una risposta più elevata ai livelli di espressione genica di TNF e IL1B rispetto al modello equivalente di monocoltura A5497. D'altra parte, entrambi i modelli hanno mostrato variazioni più elevate all'interno dei valori di rilascio del mediatore proinfiammatori misurati rispetto alle monocolture A549. Ciò può essere spiegato dall'uso di cellule immunitarie di diversi donatori (cappotti di bufala) all'interno di ripetizioni biologiche (cioè, una ripetizione, un donatore), come mostrato inprecedenza 7. Se lo si desidera, le variazioni tra le repliche possono essere superate di 1) utilizzando PBM scongelati dello stesso donatore o 2) un pooling di PBM da diversi donatori prima di congelare le cellule, quindi il successivo utilizzo dello stesso pool in ogni ripetizione. Si raccomanda anche l'inclusione di più ripetizioni biologiche.
La tecnica di congelamento delle cellule può essere considerata come un passo critico; tuttavia, è una procedura di laboratorio comune per preservare le cellule per l'analisi fenotipico e funzionale. Vari studi hanno dimostrato che la qualità dei PBM congelati è vitale per la loro sopravvivenza, e un'adeguata tecnica di congelamento è la chiave per il successo dei successivi saggi con le stessecellule 28,32. La modifica del protocollo può essere eseguita congelando i PBM, che fornisce flessibilità nella configurazione sperimentale, in quanto la disponibilità di cappotti buffy è solitamente limitata. Un altro vantaggio dell'utilizzo di PBM congelati (in diverse fiale) rispetto a quelli appena isolati è che possono essere utilizzati in esperimenti successivi anche dopo 1 anno. Questo riduce il potenziale problema della variabilità da donato a donatore se si tratta di un parametro desiderato o obbligatorio in uno sperimentale.
I risultati di un confronto interlaboratorio effettuato dopo un massimo di 13 mesi mostrano che i PBM, se correttamente conservati in un serbatoio di azoto liquido, possono essere utilizzati per un lungo periodo senza alcun effetto sulla vitalità cellulare o sul recupero cellulare33. Tempi di conservazione più lunghi (oltre 1 anno) possono essere possibili dopo un'attenta convalida della vitalità cellulare e della reattività delle cellule prima di eseguire un esperimento. Inoltre, la temperatura nel serbatoio di azoto liquido deve rimanere stabile in ogni momento. Il fattore principale che influisce sulla fattibilità dei PBM crioconservati è risultato essere la concentrazione DMSO, con una concentrazione ottimale del 10%-20 % (v/v)28. Per ridurre al minimo gli effetti potenzialmente dannosi del congelamento, diverse fonti di proteine, FBS o BSA (con un'ampia gamma di concentrazione dal 40% fino al 100 %34) sono spesso aggiunte al mezzo di congelamento come componenti protettivi naturali che possono aumentare la sopravvivenza delle cellule.
A causa dell'elevato potenziale citotossico del DMSO, si consiglia prima di disperdere i PBM in FBS, quindi aggiungere DMSO ai PBM già dispersi in FBS. In particolare, sebbene concentrazioni più elevate di FBS (>40%) non ha mostrato alcun miglioramento della vitalità cellulare, allo stesso tempo, non hanno causato danni alle cellule28. Tuttavia, congelare i monociti è un possibile approccio per superare i problemi di disponibilità limitata del cappotto buffy. Tuttavia, se si desidera l'uso di MDDC e MMI da MPM freschi, le cellule immunitarie possono essere differenziate e utilizzate 5-8 giorni dopol'isolamento 7,16,17,35,36,37. Se la pianificazione sperimentale lo consente, si raccomanda almeno 6 giorni di differenziazione sia negli MDDC che negli MMM. Tuttavia, la coerenza tra le diverse ripetizioni nello stesso esperimento, insieme alle ispezioni di routine delle loro espressioni specifiche dei marcatori di superficie, sono cruciali. Anche la reattività a uno stimolo proinfiammatorio, come LPS, dopo il tempo di differenziazione deve essere regolarmente controllata.
Molte indagini che utilizzano la linea cellulare A549 sono state eseguite all'ALI, sia come monocultura che in combinazione con altri tipi di cellule (macrofagi, cellule dendritiche o fibroblasti) nel modello di cocoltura 3D22,24,29,38. Utilizzando questo modello di cocoltura 3D, la citotossicità, lo stress ossidativo o gli effetti proinfiammatori di (nano-)materiali sono stati studiati per un massimo di 72 h1,17,21,24,29. La somiglianza del modello con il tessuto in vivo è stata precedentemente studiata sulla base dell'imaging a scansione laser confocale del modello16. Quando si assembla il modello, è importante considerare sia la proliferazione cellulare (che può influenzare A549 nel modello qui presentato) sia le prestazioni delle cellule immunitarie primarie (non proliferare) (qui, MDDC e MDM). È inoltre importante considerare che non tutti i monociti positivi del CD14 si differenziano in MDDC e MSM e che le cellule possono essere presenti sia in forma collegata che sospesa. In base alla natura dell'assieme della cocoltura (qui, entrambi i tipi di cellule devono essere attacchi allo strato epiteliale esistente), si consiglia di utilizzare solo le sotto-popolazioni aderenti di entrambi i tipi di cellule immunitarie. Inoltre, le analisi di routine di monociti, mdDC e risposta della monocultura MDM a LPS ed espressione di marcatori di superficie specifici (CD14, CD163, CD86, CD93 o CD206, dati non mostrati) hanno suggerito che 6 e 7 giorni di differenziazione sono i punti di tempo ottimali.
Anche se un numero realistico di cellule epiteliali alveolar nei polmoni umani corrisponde a 160.000 dollari/cm2, il numero di cellule A549 conteggiate nel modello è di 1.000.000 di cellule/cm2 dopo 9 giornicolturati sull'inserto 16,18. Pertanto, è necessario considerare i limiti di questo modello in vitro. In primo luogo, la densità delle cellule epiteliali è stata stabilita in base alla loro capacità di formare uno strato confluente sulla membrana in crescita. È anche importante ricordare che l'A549 rappresenta una cellula epiteliale di tipo II con una forma cuboiale, contrariamente alle cellule epiteliali di tipo I, che sono piatte e dispanate. D'altra parte, il numero richiesto di cellule immunitarie è stato stabilito sulla base della letteratura e presentato in questo protocollo come numero di cellulare / superficie area39,40,41. La densità cellulare degli MDDC nell'intervallo di 400 celle/mm2 (4 celle/cm2)16 è paragonabile alla densità delle cellule a stato costante di 500-750 cellule/mm2 (5- 7 cellule/cm2) riportata dagli studi in vivo39. La densità degli MMM in questo modello rientra nella stessa gamma di situazione in vivo nella regione alveolar umana40.
La colorazione matura del marcatore macrofago (25F9) è stata osservata sia nel lato apoco (dove sono presenti gli MSM) sia sul lato basale (cioè nel sito delle cellule dendritiche). La traslocazione delle cellule immunitarie attraverso i pori di inserti della membrana è possibile ed è stata osservata ancheutilizzando questo modello 16, che può spiegare le differenze osservate nelle intensità di colorazione. Tuttavia, un'altra possibile spiegazione è che il marcatore di macrofago maturo può essere espresso anche sulle cellule dendritiche, ma l'espressione è altamente specifica deldonatore 42. Inoltre, l'intensità dell'espressione 25F9 è molto più elevata negli MMM (Figura 7, Figura 8). Entrambi gli stimoli proinfiammatori (LPS e TNF-z) hanno influito sull'integrità della barriera epiteliale polmonare in entrambe le coculture (Figura 7, Figura 8). Questo era previsto sulla base di precedentipubblicazioni 43,44 che mostrano che le citochine proinfiammatiche e i prodotti batterici interrompono l'integrità delle barriere epiteliali.
Il modello multicellulare 3D dell'epitelio alveolare umano, stabilito e caratterizzato inprecedenza 17,è servito come strumento potente e utile per valutare le risposte biologiche (cioè, reazioni proinfiammatori acute, risposta allo stress ossidativo, distribuzione di particelle e comunicazione cellulare) in vitro21,24,25,45. I risultati confermano la responsabilità dei modelli di cocoltura a stimoli proinfiammatori (qui, LPS e TNF-z). La risposta è stata leggermente aumentata quando si utilizzano cellule immunitarie da PBM freschi; tuttavia, non vi era alcuna differenza statisticamente significativa tra le cocolture che utilizzano PBM freschi e scongelati. Inoltre, le reazioni proinfiammatorie di entrambi i modelli di cocoltura erano superiori a quelle delle monocolture cellulari epiteliali coltivate nelle stesse condizioni (ALI). In sintesi, il protocollo descrive l'assemblaggio di un modello di cocoltura del tessuto epiteliale alveolar umano 3D utilizzando PBM freschi o scongelati per la differenziazione in MDM e MDDC. È dimostrato che entrambi i modelli sono altamente reattivi agli stimoli proinfiammatori; pertanto, possono servire come potenti strumenti per potenziali valutazioni dei pericoli e della tossicità.

Le colture di cellule polmonari in vitro offrono piattaforme convenienti, robuste e ben controllate per valutare i rischi degli aerosol1. Come sistema cellulare modello per gli pneumociti alveolari umani, la linea cellulare epiteliale A549 isolata da un adenocarcinoma polmonare vienespesso utilizzata 2. Queste cellule rappresentano cellule epiteliali squamose di tipo II della regione alveolar3 e sono una linea di cellule polmonari ampiamente utilizzata per la valutazione del pericoloedellatossicità 1,4,5,6,7,8,9,10. La linea cellulare A549 possiede caratteristiche rilevanti delle cellule epiteliali alveolari di tipo II, come la presenza di caratteristici corpi lamellari contenenti fosfoloidi densamente imballati3.
È stato dimostrato che quando le cellule vengono colturate in un'interfaccia aria-liquido (ALI), il surfactant viene rilasciato sul lato apico delle cellule epiteliali esposte all'aria, riducendo la tensionesuperficiale 11,12,13. Questa caratteristica è particolarmente importante nelle indagini sul rischio respiratorio nanomateriale e sulle indagini sulla tossicità. Una volta che i nanomateriali/tossici inalati vengono depositati nella regione alveolar, interagiscono prima con il surfactant polmonare e vengono spostati dalle forze bagnanti nell'ipofrode aqueo, dove l'interazione con le cellule polmonariavviene 14,15. Anche se le cellule A549 formano un monostrato (che può sovracrescere in multistrati in punti di tempo successivi quando coltivate all'ALI) e producono surfactant, uno svantaggio è la loro formazione di giunzione stretta insufficiente, con conseguente basso transepithelial valori di resistenza elettrica, ma ancora presentando una barriera funzionale contro intercellulare (nano)particelle traslocazione16,17,18.
Nei polmoni, c'è una varietà di popolazioni di cellule immunitarie, tra cui cellule fagone e professionali che presentano antigeni (cioè macrofagi e cellule dendritiche) che comunicano direttamente attraverso il contatto cellulare o la segnalazione intercellulare per controllare e mantenere l'omeostasi. I macrofagi e le cellule dendritiche sono effetti immunitari innati critici e iniziatori della risposta immunitaria adattiva19. Le cellule dendritiche che risiedono all'interno o sotto l'epitelio possono formare sporgenze attraverso l'epitelio al lume per catturare gli antigeni. I macrofagi alveoli si trovano sulla superficie apica dell'epitelio e fungono da cellule sentinella, che rappresentano la prima difesa cellulare contro il materiale estraneo e le infezioni batteriche, virali e fungine. La loro plasticità fenotipica consente una rapida induzione di reazioni proinfiammatorie in risposta a tali stimoli e il passaggio a innescare reazioni antinfiammatorie (cioè inibitorie)20.
Per simulare la barriera del tessuto epiteliale alveolar umano, abbiamo stabilito un modello di tripla cocoltura con cellule A549 integrate con macrofagi derivati da monociti del sangue umano (MDM) e cellule dendritiche (MDDC) rispettivamente sui lati atici e basali,rispettivamente 17. Coltivazione di questo modello ad ALI è stato precedentemente segnalato16, anche fino a 72 h post-esposizione21. Le risposte immunitarie acute alle esposizioni ai nanotubi di carbonio sono state significativamente migliorate nella coltura cellulare esposta all'ALI rispetto alle condizioni sommerse22. Il modello di cocoltura, colto ed esposto a diversi materiali di ALI, è stato precedentemente utilizzato per studiare la citotossicità, lo stress ossidativo e le risposte infiammatorie all'esposizione all'ossido di zinco,23 materiali correlati algrafene 24, nanoparticelled'oro 25,26, nanotubidi carbonio 21e particelle di sangue vulcanico e gasolio di scarico27.
Inoltre, è stato confermato l'importante ruolo dei macrofagi e delle cellule dendritiche come cellule effreenti immunitarie in un modello polmonare umano in vitro. In particolare, una maggiore risposta proinfiammatoria nel modello è stata osservata solo in presenza di cellule immunitarie rispetto ai sistemi di monocoltura7. I potenziali inconvenienti derivanti dall'uso di cellule immunitarie derivate da monociti primari sono la limitata accessibilità dei PBM e la variazione da donatore a donatore. Come soluzione a questi potenziali inconvenienti, presentato qui è un protocollo che introduce la crioconservazione di PBM28 appena isolati per l'assemblaggio del modello di coltura cellulare. Lo scopo di questo studio è dimostrare l'assemblaggio del modello di tessuto epiteliale alveolar umano 3D, compreso l'isolamento dei PBM dai cappotti di buffy umani. La reattività agli stimoli proinfiammatori viene confrontata con il modello composto da MMM e MDDC differenziati da PBM freschi o differenziati dai PBM congelati/scongelati.
Lavorare con campioni di sangue umano non testati comporta cure specifiche per prevenire la potenziale trasmissione di malattie infettive, come l'HIV (virus dell'immunodeficienza umana), l'epatite B e l'epatite C. Pertanto, l'uso di misure di protezione personale come guanti, abiti, maschere e protezione degli occhi sono cruciali e devono essere conformi ai principi di buona pratica di laboratorio. Queste protezioni riducono il rischio di esporre la pelle o le membrane mucose a fluidi potenzialmente infettivi. Inoltre, per coloro che sono coinvolti nella manipolazione di cappotti di buffy e PBM, la vaccinazione contro il virus dell'epatite B è obbligatoria e i livelli di emabrazione degli anticorpi anti-epatite B devono essere superiori a 100 IU/L (devono essere affrontati i requisiti legislativi specifici del paese). Inoltre, tutto il lavoro deve essere svolto nei laboratori di biosafety di livello 2 (devono essere affrontati i requisiti legislativi specifici per paese). Quando si esegue l'intero protocollo, devono essere adottate le precauzioni standard in materia di salute e sicurezza associate al lavoro in un ambiente di laboratorio e alla manipolazione della coltura cellulare dei mammiferi, compresa la manipolazione dei rifiuti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

Un modello di coculazione cellulare alveolar umana è descritto qui per la simulazione della barriera del tessuto epiteliale alveolar composto da cellule epiteliali alveolari di tipo II e due tipi di cellule immunitarie (cioè macrofagi derivati da monociti umani [MDM] e cellule dendritiche [MDDC]). Viene fornito un protocollo per l'assemblaggio del modello multicellulare. Le cellule epiteliali alveolare (linea cellulare A549) vengono coltivate e differenziate in condizioni sommerse su inserti permeabili in pozzi a due camere, quindi combinate con MDM e MDDC differenziati. Infine, le cellule sono esposte a un'interfaccia aria-liquido per diversi giorni. Poiché le cellule immunitarie primarie umane devono essere isolate dai cappotti umani, le cellule immunitarie differenziate dai monociti freschi o scongelati vengono confrontate al fine di adattare il metodo in base alle esigenze sperimentali. I modelli tridimensionali, composti da cellule alveolari con cellule immunitarie appena isolate o scongelate derivate da monociti, mostrano un aumento statisticamente significativo del rilascio di citochine (interleukins 6 e 8) dopo l'esposizione a stimoli proinfiammatori (lipopolysaccharide e fattore di necrosi tumorale) rispetto alle cellule non trattate. D'altra parte, non vi è alcuna differenza statisticamente significativa tra il rilascio di citochine osservato nelle coculture. Ciò dimostra che il modello presentato è sensibile agli stimoli proinfiammatori in presenza di MDM e MDDC differenziati dai monociti del sangue periferico freschi o scongelati (PBM). Pertanto, è un potente strumento per le indagini della risposta biologica acuta a diverse sostanze, tra cui farmaci aerosolizzati o nanomateriali.

I modelli di coculazione polmonare umana, composti da cellule epiteliali alveolari e cellule immunitarie, sono stati assemblati da MDDC freschi o congelati e progenitori MDM (qui, monociti periferici periferici umani derivati dal sangue). Come illustrato nella Figura 1, le cellule A549 sono state seme 3 giorni dopo la prima sezione che riguarda l'isolamento/scongelamento dei monociti. Dopo 6 giorni di differenziazione, gli MSM differenziati apparivano a forma rotonda, mentre gli MDDC formavano una forma più allungata con sporgenze osservabili. Essi sono anche apparsi come agglomerati, soprattutto se differenziati da monociti freschi (Figura 2, Figura 3). Le cellule epiteliali formavano uno strato di cellule dense dopo 3 giorni di crescita sugli inserti a membrana (Figura 4), quando le coculture erano assemblate. Dopo 24 h di assemblaggio e altri 24 h di essere sottoposti a condizioni di ALI, le coculture sono state preparate per le esposizioni.
La reattività dei modelli di coltura cellulare 3D è stata studiata dopo l'esposizione a stimoli proinfiammatori noti utilizzando un approccio pseudo-ALI, come descritto inprecedenza 29. Gli stimoli proinfiammatori, LPS e TNF-z, sono stati aggiunti in bassi volumi (100 L) sulla superficie apica del modello cellulare esposto all'aria. Parallelamente, l'assenza di rottura della membrana come misura della citotossicità è stata valutata tramite analisi LDH. Un aumento significativo del rilascio di LDH nel CCM del compartimento basale è stato osservato dopo l'esposizione al controllo positivo per la rottura della membrana, un detergente Triton-X 100 (Figura 5). Questi risultati hanno dimostrato la reattività del modello a una sostanza citotossica, mentre nessun aumento del rilascio di LDH è stato osservato sulla stimolazione apica con TNF-z o LPS.
Una possibile ragione per i diversi valori misurati di LDH nei campioni assemblati con PBM freschi o precedentemente congelati può essere attribuita allo stoccaggio del campione. I campioni provenienti da PBM freschi sono stati conservati per un periodo più lungo a -80 gradi centigradi; pertanto, l'attività dell'enzima LDH può diminuire. In particolare, LDH è stabile solo fino a 4 giorni in CCM; quindi, si consiglia di eseguire il saggio gli ultimi 2 giorni dopo la raccolta dei supernatanti. In alternativa, è possibile congelare i supernatanti subito dopo la raccolta. Tuttavia, è importante considerare che il congelamento può diminuire l'attività ezimatica di LDH.
La secrezione di mediatori proinfiammatori (qui, TNF-z e interleukins 6 [IL-6] e 8 [IL-8]) nel CCM basale è stata quantificata tramite ELISA. Gli aumenti statisticamente significativi (p < 0,05, ANOVA uni controllo) sono stati osservati nel rilascio di IL-6 e IL-8 sia nei campioni trattati da LPS che in TNF-z rispetto alle rispettive cellule non trattate, nonché nei modelli di coltura cellulare assemblati da una delle due origini PBM (Figura 6). Sebbene le concentrazioni (pg/mL) di tutte le citochine testate nella CCM basale fossero più elevate nelle coculture composte da PBM freschi, le differenze tra le due coculture e monocolture non erano statisticamente significative (p > 0,05)(Figura 6). Per confermare il valore aggiunto dei modelli di cocoltura rispetto a una coltura cellulare epiteliale 2D, le monocolture A549 sono state esposte anche a LPS o TNF- . Come previsto, il rilascio di tutti i mediatori studiati dalle monocolture A549 è stato inferiore rispetto a entrambi i modelli di cocoltura; anche se, la differenza tra di loro non era statisticamente significativa (p > 0,05, ANOVA univo).
La morfologia cellulare della barriera del tessuto epiteliale alveolar umano 3D è stata valutata tramite microscopia a scansione laser confocale (LSM). Per visualizzare la composizione di ogni modello, i macrofagi all'interno dei modelli di cocoltura (MMM) sono stati macchiati con il marcatore di macrofago maturo 25F9. Gli MDDC sono stati macchiati di CD83, che è un marcatore importante per le cellule dendriticheattivate 30. Per quanto riguarda la morfologia cellulare, non è stata osservata alcuna differenza tra i modelli di cocoltura che utilizzano MMM e MDDC da PBM freschi rispetto a quelli che utilizzano PBM scongelati. Nelle coculture esposte da LPS e TNF- , entrambe composte da cellule immunitarie fresche e congelate, è stato osservato uno strato epiteliale interrotto nelle immagini LSM, che non era il caso nelle cellule non trattate (Figura 7, Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Figura 1: sequenza temporale schematica del protocollo. Presentazione della preparazione, dell'assemblaggio e dell'applicazione del modello di cocoltura 3D (esposizione a una sostanza testata). ALI - interfaccia aria-liquido, MDDC - cellule dendritiche derivate da monociti, MMM - macrofagi derivati da monociti, PBM , monociti del sangue periferici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Figura 2: MPM e MDDC differenziati dai nuovi PBM. Immagine di microscopia a contrasto di fase di MDMdifferenziati( A ) e (B) da MPM freschi (6 giorni dopo l'isolamento delle cellule). Gli MMM sono a forma rotonda, mentre gli MDDC sono spesso osservati come agglomerati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Figura 3: MPM e MDDC differenziati dai PBM congelati. Immagine di microscopia a contrasto di fase di MDMdifferenziati( A ) e (B) MDDC da PBM scongelati (6 giorni dopo lo scongelamento). Gli MMM sono a forma rotonda, ma alcune cellule allungate possono essere osservate. Gli MDDC appaiono anche a forma rotonda con protrusioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Figura 4: Crescita delle cellule epiteliali sugli inserti a membrana. Immagine di microscopia a contrasto di fase di A549 confluente che cresce su un inserto a membrana 4 giorni dopo la semina, formando un denso strato di cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Figura 5: Risultati della citotossicità studiati tramite analisi A base di rottura della membrana (LDH). I dati sono presentati come un aumento di piegatura rispetto alle celle non trattate (media : SD, n e 3, l'asterisco indica un aumento statisticamente significativo rispetto alle celle non trattate, "p < 0,01, "p < 0.0001). Nei modelli verdi sono rappresentati MMM e MDDC da MPM freschi e in modelli viola assemblati da PBM scongelati sono rappresentati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Figura 6: Reazioni proinfiammatorie nelle coculture e nelle monocolture. I mediatori proinfiammatori (TNF-z, IL-6 e IL-8) rilasciano nelle coculture dopo 24 h sfida con LPS o TNF-. I dati vengono presentati in relazione alle celle non trattate (media : SD, n e 3, p < 0,01, p < 0,001, p < 0,001). Nei modelli verdi sono rappresentati MMM e MDDC da MPM freschi e in modelli viola assemblati da PBM scongelati sono rappresentati. Il grigio rappresenta le monocolture A549. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Figura 7: Morfologia delle coculture composta da cellule immunitarie fresche. Immagini LSM di lati apicali e basali del modello di cocoltura con proiezioni xz di lati apicali del modello utilizzando MMM e MDDC da MPM freschi. Cyan rappresenta i nuclei (DAPI), magenta rappresenta il citoscheletro (rhodamine-phalloidin), il bianco rappresenta gli MMM (25F9) e il verde rappresenta gli MDD (CD 83). La freccia bianca indica MDM, mentre la freccia verde indica MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Figura 8: Morfologia delle coculture composte da cellule immunitarie congelate. Immagini LSM del lato apical del modello di cocoltura con proiezioni xz corrispondenti e lato basale del modello che utilizza MDM e MDDC da MPM scongelati. Cyan rappresenta nuclei (DAPI), magenta rappresenta citoscheletro (rhodamine-phalloidin), bianco rappresenta MDM (25F9) e verde rappresenta MDDCs (CD 83). La freccia bianca indica MDM, mentre la freccia verde indica MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Qui è presentato un protocollo per l'isolamento primario del sangue monocito umano, nonché la loro differenziazione in macrofagi e cellule dendritiche e assemblaggio con cellule epiteliali in un modello polmonare umano multicellulare. Vengono confrontate le risposte biologiche delle coculture composte da cellule immunitarie differenziate dai monociti appena isolati o scongelati, dopo l'esposizione a stimoli proinfiammatori.

Modello alveolare umano multicellulare composto da cellule epiteliali e cellule immunitarie primarie per la valutazione del pericolo

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Questi singoli modelli audio umani utilizzano cellule immunitarie rilevanti come potente strumento per prevedere la risposta immunitaria acuta di sostanze tra cui nanomateriali e farmaci per la conoscenza. Questi medici combinano cellule epiteliali umane e cellule immunitarie primarie umane per valutare tali reazioni specifiche. L'uso di monociti freschi e congelati offre flessibilità per il piano di esperimento.Numerosi studi hanno dimostrato che questo modello può fornire una visione della comunicazione interstellare tra senso del comportamento e senso immunitario. Poiché questa dimostrazione include tutti i dettagli importanti per studiare il modello come tratto personale nella coltura cellulare, istruzioni visive per replicare gli esperimenti. Diversi passaggi del protocollo della vescica sono complessi e richiedono una manipolazione speciale.Pertanto vengono dimostrati con tutti i dettagli richiesti che possono essere facilmente seguiti. Per l'isolamento dei monociti di sangue periferico dai cappotti Buffy umani, dividere il contenuto del sacchetto del mantello Buffy raccolto, uniformemente tra 250 tubi conici milliliter. Portare con cura il volume totale in ogni tubo 250 millilitri con PBS e mescolare i tubi con tre dolci inversioni.Quindi dividere equamente la soluzione PBS del mantello Buffy tra quattro nuovi tubi da 50 millilitri, quindi aggiungere 10 microlitri di perline magnetiche positive CD 14 alla settima celle totali al tubo e mescolare bene con la pipettazione. Al momento del riempimento, staccare la pipetta dalla pipetta e collegare immediatamente l'apertura superiore della pipetta con un pollice, quindi posizionare la pipetta riempita nella parte inferiore di un tubo e scollegare l'apertura della pipetta per consentire al mezzo gradiente di densità di fluire lentamente sotto la miscela PBS del mantello buffy, fino a quando un millilitro del mezzo gradiente di densità viene lasciato all'interno della pipetta. Quando il mezzo gradiente di densità è stato aggiunto a ciascun tubo allo stesso modo, separare le cellule per centrifugazione gradiente di densità e utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere lo strato bianco di cellule mononucleari del sangue periferico spesso da due a tre millimetri tra il plasma e gli strati medi gradienti di densità.Il modo migliore per collegare il livello è rimuovere prima il plasma e quindi sopprimere le nostre pipette logiche per raccogliere le cellule. Estrarre le cellule mononucleari del sangue periferico da ogni insieme di due tubi in un nuovo tubo da 50 millilitri e lavare le cellule due volte con un volume totale di 50 millilitri di PBS fresco per lavaggio. Quindi scartare il supernatante e rimescolare la pipetta in ciascuno in cinque millilitri di PBS fresco e mettere in comune le sospensioni cellulari in un unico tubo per il conteggio.Dopo il conteggio, centrifugare di nuovo le cellule e rimospendare la pelette a 80 millilitri di tampone di separazione magnetica per assistere alla settima parte. Quindi aggiungere 10 microlitri di perline magnetiche positive CD 14 per frequentare la settima parte totale delle celle al tubo e mescolare bene con la pipettazione. Dopo un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius sciacquare una colonna magnetica con tre millilitri di tampone di separazione magnetica e aggiungere le cellule alla colonna.Lavare la colonna tre volte con tre volumi millilitri di tampone per lavaggio e trasferire la colonna in un tubo da 15 millilitri contenente un millilitro di tampone di separazione magnetica fresco. Quindi utilizzare lo stantuffo e cinque millilitri di tampone per scaricare le celle positive CD 14 nel tubo. Indurre la differenziazione delle cellule positive isolate del CD 14 perline magnetiche.In primo luogo, rimorsi le cellule in una sola volta occuparsi delle sei cellule per concentrazione di millilitro nel mezzo di coltura cellulare. O differenziazione MDDC, aggiungere 10 nanogrammi per millilitro di e del fattore stimolante della colonia di macrofagi del sito di granula al tubo e aggiungere tre millilitri di cellule a ciascun pozzo di una piastra di coltura cellulare di sei pozzi, o differenziazione MDM aggiungere 10 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante della colonia di macrofagi alle cellule e placcare le cellule come appena dimostrato. Per impostare un modello di co-coltura del tessuto epiteliale epiteliale alveolare umano, prima trasferire 1,5 millilitri di mezzo di coltura cellulare pre-caldo nel numero appropriato di pozzi di una piastra di 12 pozzi e posizionare un inserto di coltura cellulare in ogni pozzo.Successivamente aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare epiteliale ad una densità di cinque volte 10 alla quinta cella per millilitro nel lato apicale di ogni inserto e coprire la piastra per un'incubazione di quattro giorni nell'incubatore di coltura cellulare. Oppure la semina MDDC sostituisce il supernatante dai pozzi di sei piastre di pozzo utilizzate per la differenziazione MDDC, con un millilitro di mezzo di coltura cellulare caldo fresco e utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule di aderenza da ogni pozzo. Lavare ogni bene tre volte con il supernato e in ogni pozzo e unire tutte le soluzioni cellulari in un unico tubo di centrifuga.L'MDDC raccolto per centrifugazione e pinzette sterili per posizionare gli inserti dalle 12 piastre del pozzo capovolte in una piastra di Petri sterile. Raschiare qualsiasi cellula epiteliale dal lato basale dell'inserto e risosopendire gli MDC nel mezzo di coltura cellulare fresco fare una concentrazione di 4,2 per 10 di queste cellule per millilitro. Quindi aggiungere 150 microlitri di celle su ogni inserto in modo che l'intera superficie basale dell'inserto sia ugualmente coperta con il liquido senza bolle.Per la semina MDDM dopo aver raccolto gli MDDM differenziati come dimostrato per gli MDDC, diluire le cellule a 2,5 per 10 alle quattro cellule per millilitro di concentrazione media di coltura cellulare fresca e aggiungere 500 microlitri di cellule lungo la parete di ogni cellula epiteliale e MDDC contenente inserto di coltura cellulare, quindi posizionare il coperchio sulla piastra e posizionare la piastra in un incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Il giorno dopo aspira il supernatante sia dalle aree apicali che basali di ogni inserto di coltura cellulare e pozzi. Quindi sterilizzi le pinzette per sollevare gli inserti dai pozzi e aggiungere 600 microlitri di prevendite fresco al mezzo di coltura cellulare ad ogni pozzo.Dopo sei giorni di differenziazione, gli MMM appaiono di forma rotonda mentre gli MDDC formano cluster fatti di celle con una forma più allungata e sporgenze osservabili. Dopo tre giorni di crescita su inserti di membrana, le cellule epiteliali formano un denso Un aumento significativo del rilascio di lattato deidrogenasi si osserva nel mezzo di coltura cellulare del compartimento basale dopo l'esposizione a un controllo positivo per la rottura della membrana, dimostrando la reattività del modello a una sostanza citotossica. Nessun aumento del rilascio di lattato deidrogenasi misurato sulla stimolazione apicale con TNF alfa o LPS.Aumenti statisticamente significativi nel rilascio di IL6 e IL8 si osservano sia nei campioni trattati con alfa LPS che in quello TNF rispetto alle cellule non trattate di controllo. Non si osservano differenze nella morfologia cellulare tra i modelli di co-coltura che utilizzano MDDM e MDDC da monociti di sangue periferici freschi rispetto a quelli che utilizzano cellule scongelate in co-coltura esposta alfa LPS e TNF, è stato osservato uno strato epiteliale interrotto. È possibile utilizzare altri tipi di cellule umane come le vie aeree o le cellule bronchiolari, possono essere analizzati anche altri punti finali.Principalmente i ricercatori sono stati ispirati da questa tecnica usando un simile per impostare ma con diversi tipi di cellule.

Modello alveolare umano multicellulare composto da cellule epiteliali e cellule immunitarie primarie per la valutazione del pericolo

Abstract