אנו מודים לצוות של מרכז ההתייחסות העולמי לווירוסים מתפתחים ו Arboviruses (WRCEVA): ד"ר רוברט טש, הילדה גוזמן, ד"ר קנת פלנטה, ד"ר ג'סיקה פלנטה, דיון שרטון ודיביה מירצ'נדאני, על עבודתם הבלתי נלאה באוצר ובספקת זנים ויראליים רבים המשמשים לניסויי היכולת הווקטורית שלנו ושל קבוצות אחרות. העבודה המוצגת מומנה על ידי קרן מלגות מקלפלין (SRA) ו- NIH מעניקה AI120942 ו- AI121452.

כל ההליכים שבוצעו בפרוטוקולים אלה בוצעו בעמידה מלאה בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לאבטחה ביולוגית וועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של הסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס בגלווסטון.
1. להגביר את זיקה מיק"ב בתאי Vero
<ol><li>לגדל תאי Vero (CCL-81 או VeroE6) בשינוי של Dulbecco של ...

<ol>
	<li>Azar, S. R., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence:+What+Has+Zika+Virus+Taught+Us.">Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us.</a> Viruses. 11 (9), 867 (2019).</li><li>Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+vector+competence+studies:+A+review.">Aedes aegypti vector competence studies: A review.</a> Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).</li><li>Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mosquito+Vector+Aedes+taeniorhynchus:+Infection+Initiated+by+a+Small+Number+of+Susceptible+Epithelial+Cells+and+a+Population+Bottleneck.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck.</a> Virology. 372 (1), 176-186 (2008).</li><li>Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arboviral+bottlenecks+and+challenges+to+maintaining+diversity+and+fitness+during+mosquito+transmission.">Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission.</a> Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).</li><li>Kramer, L. D., Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+vectorial+capacity+for+mosquito-borne+viruses.">Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses.</a> Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).</li><li>Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+Barriers+for+Western+Equine+Encephalomyelitis+Virus+in+Culex+tarsalis+infected+after+Ingestion+of+Low+Viral+Doses.">Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).</li><li>Lounibos, L. P., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasiveness+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+and+Vectorial+Capacity+for+Chikungunya+Virus.">Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).</li><li>Heitmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+Salivation+as+a+Method+to+Analyze+Vector+Competence+of+Mosquitoes.">Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).</li><li>Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Mosquito+Vector+Competence.">Genetics of Mosquito Vector Competence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+quinquefasciatus:+a+potential+vector+to+transmit+Zika+virus.">Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 5 (9), 102 (2016).</li><li>Secundino, N. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+transmission+to+mouse+ear+by+mosquito+bite:+a+laboratory+model+that+replicates+the+natural+transmission+process.">Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 346 (2017).</li><li>Smith, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Transmission+and+Effect+on+Pathogenesis.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis.">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection,+Pathogenesis,+and+Immunity.">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).</li><li>Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+Animal+Models+for+Arthropod-Borne+Viruses.">An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses.</a> Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).</li><li>Rossi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Novel+Murine+Model+to+Study+Zika+Virus.">Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).</li><li>Styer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+inoculate+high+doses+of+West+Nile+virus+as+they+probe+and+feed+on+live+hosts.">Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts.</a> PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).</li><li>Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+infected+Aedes+aegypti+collected+during+a+Zika+virus+outbreak+have+viral+titres+consistent+with+transmission.">Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 8 (1), 242-244 (2019).</li><li>Dzul-Manzanilla, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+vertical+transmission+and+co-circulation+of+chikungunya+and+dengue+viruses+in+field+populations+of+Aedes+aegypti+(L.)+from+Guerrero,+Mexico.">Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).</li><li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+Gabon+(Central+Africa)+&#8211;+2007:+a+new+threat+from+Aedes+albopictus.">Zika virus in Gabon (Central Africa) &#8211; 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+epidemiology+reveals+multiple+introductions+of+Zika+virus+into+the+United+States.">Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States.</a> Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+Virus+Infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+First+Confirmed+Transmission+by+Aedes+aegyti+Mosquitoes+in+the+America.">Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Lundstrom, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sindbis+virus+polyarthritis+outbreak+signalled+by+virus+prevalence+in+the+mosquito+vectors.">Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).</li><li>Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+yellow+fever+caused+by+an+incompetent+mosquito+vector.">Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector.</a> Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).</li><li>Brown, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+Mosquito+Traps+in+Measuring+Species+Abundance+and+Composition.">Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).</li><li>Gorsich, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+assessment+of+adult+mosquito+trapping+methods+to+estimate+spatial+patterns+of+abundance+and+community+composition+in+southern+Africa.">A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa.</a> Parasites &amp; Vectors. 12 (1), 462 (2019).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIKV+Demonstrates+Minimal+Pathologic+Effects+and+Mosquito+Infectivity+in+Viremic+Cynomolgus+Macaques.">ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques.</a> Viruses. 10 (11), 661 (2018).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Vector+Competency+of+Aedes+albopictus+Populations+from+the+Americas+for+Zika+Virus.">Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).</li><li>Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+for+the+Transmission-Clearance+Trade-Off+Hypothesis+from+a+Study+of+Zika+Virus+Delivered+by+Mosquito+Bite+to+Mice.">Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice.</a> Viruses. 11 (11), 1072 (2019).</li><li>Hart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Vector+Competency+of+Mosquitoes,+Gulf+Coast,+United+States.">Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).</li><li>Karna, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonized+Sabethes+cyaneus,+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species,+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti.">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434 (2018).</li><li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission.">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li><li>Wilson, A. J., Harrup, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+relevance+in+insect-arbovirus+infection+studies.">Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies.</a> Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).</li><li>Hagan, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+prompts+increased+activity+and+blood+feeding+by+mosquitoes.">Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

השיטות המתוארות כאן מספקות זרימת עבודה כללית לביצוע ניתוחי כשירות וקטורית. כמסגרת כללית, רבות מהמתודולוגיות הללו נשמרות ברחבי הספרות. עם זאת, יש מקום משמעותי לשינויים (נבדק אזר וויבר1). וירוס (למשל, שושלת ויראלית, אחסון של וירוס אתגר, היסטוריית מעבר ויראלית), אנטומולוגיה (למשל, ?...

יכולת וקטורית מוגדרת כיכולת ברמת המינים, האוכלוסייה ואפילו הפרט, של פרוקי רגליים נתון כגון יתוש, קרציה או זבוב חול פלבוטומין, לרכוש ולהעביר סוכן ביולוגית עם שכפול או התפתחות בפרוקי הרגליים1,2. ביחס ליתושים ווירוסים המועברים על ידי פרוקי רגליים (כלומר, ארבו-וירוסים), הסוכן מודבק ממארח וירמי על ידי יתושה נקבה. בעקבות בליעה, הנגיף חייב להדביק באופן פרודוקטיבי אחד מאוכלוסייה קטנה של תאי אפיתל midgut3, להתגבר על מכשולים פיזיולוגיים שונים כגון השפלה פרוטאוליטית על ידי אנזימי עיכול, נוכחות של המיקרוביוטה (מחסום זיהום midgut, או MIB), ואת מטריצה פריטרופית מופרשת. זיהום של אפיתל midgut חייב להיות מלווה שכפול של הנגיף ובסופו של דבר לברוח מן midgut לתוך מערכת הדם הפתוחה של היתוש, או המולימף, המייצג את תחילתו של זיהום מופץ להתגבר על מחסום הבריחה midgut (MEB). בשלב זה הנגיף יכול להקים זיהומים של רקמות משניות (למשל, עצבים, שרירים וגופי שומן) ולהמשיך לשכפל, אם כי שכפול משני כזה לא יכול להיות נחוץ בהחלט עבור הנגיף להדביק את תאי acinar של בלוטות הרוק (להתגבר על מחסום זיהום בלוטת הרוק). יציאה מתאי האצין של בלוטת הרוק לחללים האפיטליים שלהם ואז תנועה לתוך צינור הרוק מאפשרת חיסון של הנגיף למארחים הבאים על נשיכה, ומשלימה את מחזור השידור1,2,4,5,6,7.
בהתחשב במנגנון ההתפשטות המאופיין היטב והשמור בדרך כלל בתוך וקטור יתושים, הערכות כשירות וקטור מעבדה דומות לעתים קרובות באופן מתודולוגי, אם כי הבדלים בפרוטוקולים קיימים1,2. בדרך כלל, לאחר חשיפה לנגיף הפה, יתושים נותחים כך שרקמות בודדות כגון אמצע, רגליים, שחלות או בלוטות רוק יכולות להיבדק לזיהום ויראלי, זיהום מופץ, זיהום מופץ / שידור טרנסו-אווריאלי פוטנציאלי, וזיהום מופץ / יכולת שידור פוטנציאלית, בהתאמה8. עצם נוכחותו של וירוס בבלוטות הרוק, עם זאת, אינה עדות מוחלטת ליכולת ההדבקה, בהתחשב בראיות של מחסום בריחה /יציאה של בלוטת הרוק (SGEB) בכמה שילובים וקטור / וירוס1,2,4,5,7,9. השיטה הסטנדרטית להוכחת כשירות שידור נותרה העברת יתושים לחיה רגישה10,11,12. עם זאת, בהתחשב בכך עבור arboviruses רבים זה מחייב את השימוש של מודלים מורין immunocompromised13,14,15,16, שיטה זו היא לעתים קרובות עלות-אוסרת. חלופה נפוצה היא אוסף של רוק יתושים, אשר ניתן לנתח על ידי תגובת שרשרת שעתוק הפוך-פולימראז (RT-PCR) או בדיקה זיהומית כדי להדגים את נוכחותו של הגנום הנגיפי או חלקיקים זיהומיים, בהתאמה. ראוי לציין כי שיטות איסוף רוק במבחנה כאלה עשויות ערך יתר עלהמידה 12 או לזלזל17 את כמות הנגיף שהופקד במהלך האכלת vivo, המציין כי נתונים כאלה חייבים להתפרש בזהירות. עם זאת, שיטת מביטה היא בעלת ערך רב כאשר מנותחת מנקודת המבט של עצם נוכחות הנגיף ברוק, מה שמצביע על פוטנציאל ההדבקה.
קיימות שתי גישות עיקריות לקביעת תפקידם של וקטורים יתושים בהתפרצויות מחלות ארבו-ויראליות. השיטה הראשונה כוללת מעקב שדה, שבו יתושים נאספים בהקשר של שידור פעיל18,19,20,21,22,23,24. עם זאת, בהתחשב בכך ששיעורי ההדבקה הם בדרך כלל נמוכים למדי (למשל, שיעור ההדבקה המשוער של 0.061% יתושים באזורים של וירוס זיקה פעיל (ZIKV) במחזור בארצות הברית21), הפללה של מינים וקטוריים פוטנציאליים יכולה להיות מוטה בכבדות על ידי לכידת מתודולוגיה25,26 וסיכוי אקראי (למשל, דגימת אדם נגוע אחד מתוך 1,600 לא נגוע)21 . אם ניקח זאת בחשבון, מחקר נתון לא יכול לרכוש יתושים מספיק הן במספרים גולמיים או מגוון מינים כדי לדגום במדויק יתושים המעורבים בהעברת. לעומת זאת, ניתוחי כשירות וקטורית מתבצעים במסגרת מעבדה, המאפשרים שליטה קפדנית בפרמטרים כגון מינון אוראלי. למרות שאינם מסוגלים לייצג את המורכבות האמיתית של זיהום יתושים ויכולת שידור במסגרת שדה, הערכות מעבדה אלה נשארות כלים רבי עוצמה בתחום הארבו-וירביולוגיה.
בהתבסס על ניתוחי כשירות וקטור שונים עם ZIKV במספר מינים של יתושים, אוכלוסיות ושיטות27,28,29,30,31,32, כמו גם סקירה אחרונה של הערכות יכולת וקטורית1, אנו מתארים כאן כמה מהפרוטוקולים הקשורים לזרימת עבודה וקטורית טיפוסית. בניסויים אלה, שלוש אוכלוסיות Ae. aegypti מאמריקה (העיר סלבדור, ברזיל; הרפובליקה הדומיניקנית; ועמק ריו גרנדה התחתון, TX, ארה"ב) נחשפו לזן יחיד של ZIKV (Mex 1-7, גישה GenBank: KX247632.1) ב 4, 5, או 6יומן 10 יחידות יוצרות מיקוד (FFU)/ mL באמצעות מקת דם מלאכותי. לאחר מכן, הם נותחו לראיות לזיהום, זיהום מופץ ויכולת שידור לאחר זמנים שונים של דגירה קיצונית (2, 4, 7, 10 ו -14 ימים) באמצעות ניתוח ובסיס מדבקות מבוסס תרבות תאים. למרות שזרימת העבודה/הפרוטוקולים הנוכחיים ממוטבים עבור ZIKV, אלמנטים רבים ניתנים לתרגום ישיר לארובווירוסים אחרים המועברים על ידי יתושים ברמות בלימת פרוקי רגליים וביו-בטיחות 2 ו-3 (ACL/BSL2 או ACL/BSL3).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3mL Standard Reservoir</td>
			<td>R37P30</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/32&#34; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td>
			<td>4RJH9</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Grinding Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A16-P4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>A6419-1G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Primary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td>
			<td>5450-0011</td>
			<td>KPL/Seracare</td>
			<td>Secondary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NC0427256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Decontamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td>
			<td>10-126-34</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>C0775-100G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td>
			<td>05-402-7</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-20</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td>
			<td>13-675-15B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-30</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-22</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>08-772B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FU1 Feeder</td>
			<td>FU1-0</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; feeding units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>140-040-182</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&#956;g/mL, 50mL/Bottle</td>
			<td>15-290-026</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td>
			<td>15-140-163</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>11-965-118</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td>
			<td>7203706</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>Bloodmeal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InsectaVac Aspirator</td>
			<td>2809B</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &#176;C), 250g/Bottle</td>
			<td>M0512-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td>
			<td>C849T34</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>M5904-5X5ML</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>OR37-25</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Plugs</td>
			<td>PP5-250</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS6 Power Unit (110-120V)</td>
			<td>PS6120</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td>
			<td>4525</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td>
			<td>50-809-242</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td>
			<td>84097-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&#956;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td>
			<td>21-402-487</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-486</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-484</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-482</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>85300</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td>
			<td>5510-0030</td>
			<td>Seracare</td>
			<td>Developing solution for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

ההליכים שהוצגו מתארים מתודולוגיה כללית להדביק יתושים Aedes aegypti עם וירוס זיקה בתנאי מעבדה כדי לקבוע את קצב ההדבקה, זיהום מופץ, והעברה פוטנציאלית של הנגיף באוכלוסיית היתושים המדוברת. הליכים אלה נמצאים בשימוש נרחב עם שינויים שונים בהערכות כשירות וקטורית ברחבי העולם. הם חשובים בקביעת התפקיד הפוטנציאלי כי יתוש נתון (כלומר, מינים, אוכלוסייה, הפרט) עשוי לשחק בהעברת סוכן נתון.

שלוש אוכלוסיות של Ae. aegypti מאמריקה (סלבדור, ברזיל; הרפובליקה הדומיניקנית; ועמק ריו גרנדה, TX, ארה"ב) נחשפו לזן התפרצות של ZIKV מאמריקה (ZIKV Mex 1-7, מדינת צ'יאפס, מקסיקו, 2015) על מגוון של טיטרים של דם (4, 5, ו -6 יומן10 FFU / mL) שהוצגו בקם דם מלאכותי מבוסס אריתרוציטים אנושי שטוף. בימים 2, 4, 7, 10 ו - 14 לאחר ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus at JoVE.com

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

An aprox mediated by arbovirus, as countermeasures are largely limited to abatement of mosquitoes. So vector competence analyses are critical prevention strategies because they determine what populations and species of mosquitoes can serve as vectors for a given arbovirus, and therefore should be targeted. So one of the most important components in our toolbox for assessing the role of mosquitoes, and other vectors in transmitting infectious diseases, is the vector competence study.These are experiments where we can very precisely control, not only the species of mosquito, or tick, for example, but also geographic strains, as well as very specific strains of a different virus or other infectious organism to get very precise and well-controlled data on the risk of different species for transmitting different agents in very specific parts of the world. Working with infected mosquitoes requires dedicated facilities, training, experience, and careful planning to minimize the risks to the experimenter, as well as the risks of an escaped, infected mosquito. It's therefore quite important for new individuals in these facilities to take the time to work with uninfected blood mosquitoes to familiarize themselves with the techniques and workflow.On the day of exposure, turn on the power source in an Arthropod containment facility to preheat the feeding units. Combine freshly harvested citrated or heparinized human blood with a viral stock at a one to one volume ratio, and overlay a standard three milliliter reservoir unit with the skin of a naive uninfected mouse. Place the covered reservoir on white paper towels, and add about two milliliters of infectious blood to the reservoir one milliliter at a time.Then, inspect the paper towels to confirm that there is no leakage. 24 hours prior to performing the infectious assay, prepare 24-well cell culture plates with Vero cells, and label each well with the identity of the mosquito and sample. On the morning that the mosquitoes will be exposed to the infectious blood meal, remove the water saturated cotton balls, and attach reservoirs with the artificial blood meals to the feeding unit leads with a clear plastic containment glove box.Place the cardboard carton with the starved mosquitoes into the glove box underneath the feeding unit. Upon completion of feeding, remove the reservoir, and immerse it in freshly prepared 10%bleach. Within the glove box, pour cold anesthetized mosquitoes into a Petri dish on ice, and sort the engorged from the un-engorged mosquitoes.Pour the engorged mosquitoes back into the cardboard carton, quickly covering it with a screen and lid. Trim the excess screen mesh off of the carton, and secure the lid with tape. Add a cotton ball saturated with sterile filtered 10%sucrose to the screen, and place the carton in a large plastic secondary container with a damp sponge to maintain humidity.Incubate the secondary container at 27 degrees celsius, allowing mosquitoes ad libitum access to the sucrose until completion of experiments. Use a mechanical aspirator to acquire a predetermined number of incubated mosquitoes from the carton, capping the collection tube with a cotton round when finished. Working within the glove box, pour cold anesthetized mosquitoes into a Petri dish on ice.Remove all six of each mosquitoes legs, and place them in a pre-labeled two milliliter micro centrifuge tube with a sterilized stainless steel ball bearing and 500 microliters of mosquito collection media, or MCM. Gently place the mosquito onto a drop of mineral oil, taking care that the oil does not contact the mosquito's head or proboscis. Insert the proboscis into a micro pipette tip filled with 10 microliters of heat inactivated FBS, and allow the mosquito to salivate for 30 minutes.Eject the pipette tip with the saliva into a micro centrifuge tube with 100 microliters of MCM, and place the carcass into a separate two millimeter tube with the sterilized steel ball bearing and 500 microliters of MCM. Transport the tubes to a bead milling tissue homogenization device within a bio safety cabinet, and triturate all body and leg samples at 26 hertz for five minutes to liberate viral particles into the supernatant. Clarify all samples by centrifugation at 200 times G for five minutes to pelite cellular debris.Immediately before inoculation with samples, remove the media from the previously prepare Vero cells. Carefully aliquot 100 microliters of clarified supernatants from the bodies or legs into each well, taking care not to disturb the mosquito cell debris from the pelite. Then, incubate the plates for one hour.After the incubation, add one milliliter of methylcellulose overlay to each well, and put the plates back in the incubator for three to seven days. Remove overlay plates from the incubator, and bring them to a bio safety cabinet. Discard the methylcellulose overlay into a tray pan containing 10%bleach, and wash each well twice with PBS, discarding each wash into the tray pan.Remove the PBS, and add one milliliter of methanol-acetone per well, and allow the cells to fix onto the plate for 30 minutes. Then, discard the fixative, and leave the plates to dry. Wash each well three times with non-sterile PBS on an orbital plate rocker for 15 minutes per wash, then add one milliliter of blocking solution to each well, and rock the plate for another 15 minutes.Add 100 microliters of anti Zika Virus, or anti flavivirus primary antibody to each well, and incubate the plate with rocking overnight. On the next day, remove the primary antibody, and repeat the washes with PBS. After the last wash, add 100 microliters of secondary antibodies, and incubate the plate while rocking for one hour.Repeat the washes with PBS, then add 100 microliters of substrate development reagent per well, and rock the plate for 15 minutes. When the foci or plaques develop, halt the reaction by rinsing the plate with tap water. Pour off the tap water, and allow the plates to air dry, then quantify the viral foci to determine the number of focus forming units present in the given sample.Three mosquito populations were exposed to an outbreak strain of Zika Virus over a range of blood meal titers. Over the following two weeks, subsets of mosquitoes were processed to determine infection, dissemination, and potential transmission rate. At the lower blood meal titers, the mosquitoes from Salvador, Brazil were infected after 4, 10, and 14 days of extrinsic incubation, with no evidence of disseminated infection observed in the assayed legs.At the highest titer, the virus was detected in the legs of the mosquitoes, but not in the saliva. The mosquitoes from the Dominican Republic proved to be the most susceptible to infection, and the most transmission competent at all tested blood meal titers. Mosquitoes fed all three doses demonstrated dissemination by seven days, and transmission competence at 14 days post infection.Mosquitoes from the Rio Grande Valley in Texas, exposed to lower blood meal titers, were infected as early as four days post infection, while disseminated infections were found after 14 days. In the cohort exposed to the highest titer, infection was observed beginning from the second day post infection, and reached peaks at 4, 10, and 14 days. Disseminated infections were observed at seven days, and only a single mosquito was transmission capable at 10 days.When attempting this protocol, it's important to work safely, as opposed to quickly. So always handle infected or potentially infected mosquitoes within the confines of a glove box or a bio safety cabinet, until they've had their legs or wings removed. The basic vector competence workflow can be adapted to produce infected mosquitoes for downstream analyses, such as transmission studies, as well as to examine the interactions between mosquitoes, the virus, and the microbiome.Vector competence has been a really important tool for understanding the role of mosquitoes in transmitting viruses during epidemics of viral disease, and this has been true for many decades. But it's also a method that's evolved over the years to include new information, as we learn it, about the interactions between these viruses and the mosquito vectors. Just by way of two examples, the genetic population of the virus, the complexity of the population within the mosquito turns out the be very important for its ability to transmit, and we can now include that in vector competence studies with new methods for sequencing the viral population.We also now know that the population of bacteria and other organisms that live in the gastrointestinal tract of the mosquito can also have a major impact on their ability to transmit, and we can also evaluate that population now with new methods in sequencing. So vector competence is a method that has evolved and continues to evolve as we learn more about these complex interactions.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

Abstract