Dette arbejde blev støttet økonomisk af Kosair Charities Pediatric Heart Research Program ved University of Louisville og Organoid Project på RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSCs anvendes i vores offentliggjorte protokoller blev leveret af Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.

1. Vedligeholdelse af hiPSC'er og kardiovaskulær differentiering
<ol><li>Udvide og vedligeholde hiPSCs på tynd-coat kælder membran matrix (vækstfaktor reduceret, 1:60 fortynding) i konditioneret medium udvundet fra mus embryonale fibroblaster (MEF-CM) med menneskelige grundlæggende fibroblast vækstfaktor (hbFGF)4. BEMÆRK: Vi brugte en hiPSCs (4-faktor (Oct3/4, Sox2, Klf4 og c-Myc) linje: 201B6). Der tilsættes hbFGF ved den relevante koncentration for hver cellelinje. Laminin-511 fragm...

<ol>
	<li>Sanganalmath, S. K., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+heart+failure:+A+comprehensive+overview+of+experimental+and+clinical+studies,+current+challenges,+and+future+directions.">Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions.</a> Circulation Research. 113, 810-834 (2013).</li><li>Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-Analysis+of+Cell+Therapy+Trials+for+Patients+With+Heart+Failure.">Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure.</a> Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).</li><li>Menasch&#233;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+for+severe+heart+failure+treatment:+first+clinical+case+report:+Figure+1.">Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1.</a> European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).</li><li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration.">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Scientific Reports. 4, 6716 (2014).</li><li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages.">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Scientific Reports. 6, 29933 (2016).</li><li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts.">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).</li><li>Fujimoto, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+fetal+cardiac+graft+preserves+its+cardiomyocyte+proliferation+within+postinfarcted+myocardium+and+sustains+cardiac+function.">Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function.</a> Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).</li><li>Lancaster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+treatment+for+heart+failure:+cell-based+therapy+with+engineered+tissue.">Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue.</a> Vessel Plus. 2019, (2019).</li><li>Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscopic+hydrogel+molding+to+control+the+3D+geometry+of+bioartificial+muscle+tissues.">Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues.</a> Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes.">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).</li><li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+differentiate+to+cardiomyocytes+and+form+biosynthetic+tissues.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues.</a> PloS one. 8, 65963 (2013).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Cell+Composition+and+Geometry+on+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Engineered+Cardiac+Tissue.">Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue.</a> Scientific Reports. 7, 45641 (2017).</li><li>Kowalski, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cardiomyocyte+Alignment+from+Three-Dimensional+(3D)+Confocal+Microscopy+of+Engineered+Tissue.">Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue.</a> Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).</li></ol>

Efter afslutningen af vores undersøgelse af et lineært format, hiPSC afledt ECT5, tilpassede vi protokollen til at blande hiPSC-afledte CMs, ECs og MC'er for at lette in vitro-udvidelse af vaskulære celler i ECT'er og efterfølgende in vivo vaskulær kobling mellem ECT'er og recipient myocardium.
For at lette genereringen af større, implantable mesh ECT-geometrier brugte vi tynde PDMS-plader til at designe 3D-formene med lastningspæle, der var opstillet i forskudte...

Talrige prækliniske undersøgelser og kliniske forsøg har bekræftet effektiviteten af cellebaserede hjertegenerative behandlinger for svigtende hjerter1,,2,,3. Blandt forskellige celletyper, humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) er lovende cellekilder i kraft af deres proliferative evne, potentiale til at generere forskellige hjerte-kar-slægter4,5, og allogenicitet. Desuden har vævsteknik teknologier gjort det muligt at overføre millioner af celler på etbeskadigethjerte 5,6,,7,8.
Tidligere rapporterede vi generation af tre-dimensionelle (3D) lineær manipuleret hjertevæv (ECTs) fra hiPSC-afledte hjerte-kar-slægter ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kultursystem til 3D bioartificialt væv5,7. Vi fandt, at sameksistensen af vaskulære endotelceller og vægmaleri celler med kardiomyocytter inden for ECT lettet strukturelle og elektrofysiologiske væv modning. Desuden validerede vi det terapeutiske potentiale af implanterede hiPSC-ECT'er i en immuntolerant rotte myokardieinfarkt model for at forbedre hjertefunktionen, regenerere myokardiet og forbedre angiogenese5. De lineære ECT'er, der blev fremstillet ved denne metode, var imidlertid 1 mm med 10 mm cylindre og var derfor ikke egnede til implantation i prækliniske undersøgelser med større dyr eller klinisk anvendelse.
Baseret på en vellykket brug af væv forme til at generere porøse manipuleret væv dannelse ved hjælp af rotte skelet myoblaster og cardiomyocytes9, humane ESC-afledte cardiomyocytes10 og mus iPSCs11, vi udviklet en protokol til at generere skalerbare hiPSC-afledte større implantable væv ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS) forme. Vi evaluerede en række skimmelgeometrier for at bestemme de mest effektive mugegenskaber. Mesh-formede ECT'er med flere bundter og vejkryds udviste fremragende egenskaber i celle levedygtighed, vævsfunktion og skalerbarhed sammenlignet med plain-sheet eller lineære formater, der manglede porer eller vejkryds. Vi implanterede den mesh-formede ECT i en rotte myokardieinfarkt model og bekræftede dens terapeutiske virkninger svarende til implanterede cylindriske ECT'er12. Her beskriver vi protokollen til at generere en hiPSC-afledt mesh-formet ECT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm style</td>
			<td>Falcon/ Thomas scientific</td>
			<td>9380C51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS</td>
			<td>Falcon / Thomas scientific</td>
			<td>6902A01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AM-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4, recombinant (10&#181;g)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>RSD-314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF (165) IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-109-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, 0.2 &#181;m filtered (10% Solution in Water)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P-6866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>060-04543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50&#181;g)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh Wnt-3a (10&#181;g)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium and supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptro Ethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement minus insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (500ml)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (500ml)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11900024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences</td>
			<td>BD / Fisher</td>
			<td>560380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MS-295-P0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Clean Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSRinse Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (500ml)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences</td>
			<td>BD / Fisher</td>
			<td>558821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47306-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences</td>
			<td>BD / Fisher</td>
			<td>560411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Z25002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mesh-shaped engineered cardiac tissues derived from human ips cells for in vivo myocardial repair

Den nuværende protokol beskriver metoder til at generere skalerbare, mesh-formede manipuleret hjertevæv (ECTs) bestående af hjerte-kar-celler fremstillet af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC), som er udviklet mod målet om klinisk brug. HiPSC-afledte kardiomyocytter, endotelceller og vaskulære vægmalericeller blandes med gelmatrix og hældes derefter i en polydimethylsiloxan (PDMS) vævsform med rektangulære interne forskudte stolper. Ved kulturdag 14 ECT'er modnes til en 1,5 cm x 1,5 cm mesh struktur med 0,5 mm diameter myofiber bundter. Kardiomyocytter tilpasse sig den lange akse af hvert bundt og spontant slå synkront. Denne fremgangsmåde kan skaleres op til en større (3,0 cm x 3,0 cm) mesh ECT og samtidig bevare konstruktørning og funktion. Således kan mesh-formede ECTs genereret fra hiPSC-afledte hjerteceller være muligt for hjerteregenerering paradigmer.

Figur 1A,B viser skemaerne i CM+EC- og MC-protokollen. Efter at have induceret CCs og ECs fra CM + EF-protokol og MC'er fra MC-protokollen, cellerne er blandet justering endelige MC koncentrationer til at repræsentere 10 til 20% af den samlede celler. Den 2 cm brede vævsform fremstilles i henhold til designtegningen fra 0,5 mm tykt PDMS-ark (Figur 2A,B). Seks millioner CM + EC + MC celler er kombineret med kollagen I, og matri...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair at JoVE.com

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Denne protokol genererer mesh-formet manipuleret hjertevæv, der indeholder hjerte-kar-celler stammer fra humane inducerede pluripotente stamceller til at tillade undersøgelse af celle implantation terapi for hjertesygdomme.

Forberedelse af mesh-formet manipuleret hjertevæv stammer fra humane iPS-celler til In Vivo Myokardiereparation

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Denne protokol beskriver en ædel og nem metode til at skabe mesh-formet manipuleret hjertevæv stammer fra humane inducerede kropsdele og STEM celle afledte hjerteceller. Fleksibiliteten i vævsgeometrien og skalerbarheden af den bevarede vævsfunktion er de vigtigste fordele ved denne teknik. Den implanterede mesh form ECTs kan genoprette en hjertestruktur og funktion i en rotte myokardieinfarkt model.Bekræfter dens gennemførlighed til brug i hjertegeneriv behandling. Disse teknikker kræver reproducerbar human STEM celle behandling og væv kultur færdigheder for ensartede resultater. Begynd med at skære en hærdet PDMS ark til den passende størrelse, så arket skal limes med silikone lim til at fremstille en 21 af 20,5 millimeter rektangulære bakke med syv millimeter lang 0,5 millimeter bred og 2,5 millimeter høj rektangulære stillinger på forskudte positioner.Den vandrette afstand mellem to linjer stolper skal være 2,5 millimeter. Autoklave bakken ved 120 grader Celsius i 20 minutter før belægning formen med 1%Poloxamer 407 i PBS i en time. Skyl derefter formen grundigt med PBS og læg formen i en brønd af en seks-brønds plade.For afstamning analyse, kombinere cellerne fra cardiomyocyte plus endotel og vaskulære vægmaleri celle protokoller. Således at den endelige koncentration af vægmaleri celler er 10 til 20% i et samlet celletal på seks gange 10 til de seks celler pr konstruere. Bland 133 mikroliter af Acid Opløselige Rat Tail kollagen type en opløsning og 17 mikroliter af Alkali Buffer til 17 mikroliter af 10X Minimum Essential Medium på is.Derefter tilsættes 67 mikroliter af Basement Membrane Matrix til kollagenopløsningen. Dernæst centrifuge cellerne og resuspend pellet i 167 mikroliter af Høj Glucose Dulbecco's Minimal Essential Medium suppleret med føtal kvæg serum og antibiotika. Bland cellerne på matrixopløsningen på is.Hæld derefter forsigtigt 400 mikroliter af cellematrixsuspensionen på poloxamer 407 belagt PDMS-vævsform. Inkuber cellematrixblandingen i en standardcellekulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid i 60 minutter. Når vævet er dannet, forsigtigt suge formen med fire milliliter AF ECT kultur medium og returnere pladen til cellekultur inkubator i 14 dage.Før ECT-implantation steriliserede du fine sslag for omhyggeligt at fjerne ECT fra lastningspælene. Væv forme kan fremstilles med forskellige mønstre, post længder og post afstand til at generere forskellige endelige ECT geometrier. Til denne analyse blev der anvendt en støbeform med syv millimeter lange stolper med 2,5 millimeter brede intervaller.Poloxamer 407 forhindrer vedhæftning af cellerne til formen og muliggør dannelsen af en karakteristisk mesh struktur, efter hurtig gel komprimering i 14 dage. Strukturen opretholdes, selv efter ECT er frigivet fra formen. Den fabrikerede væv konstruktion er ca 1,5 centimeter bred og 0,5 millimeter tyk.Og bredden af hvert bundt i masken er ca. 0,5 millimeter i gennemsnit. Det er muligt at generere en 3 centimeter endelig bredde mesh ECT indeholder 24 millioner celler fra en fire gange større skimmel med samme forskudt post design. Denne større mesh ECT kan også let fjernes fra formen og genererer en lokal krafthandling svarende til de mindre mesh ECT.Det er vigtigt at hælde cellematrixblandingen jævnt ind i vævsformen uden at generere bobler for at forhindre følelse af defekter i den endelige gel. Funktionel karakterisering af entreprenøren. og fjerde frekvensrelationer kan udføres ved hjælp af indbyggede systemer.Vores ultimative mål er oversættelse af ECT-paradigmer til kliniske behandlingsformer, der anvender store prækliniske dyreundersøgelser.

Forberedelse af mesh-formet manipuleret hjertevæv stammer fra humane iPS-celler til In Vivo Myokardiereparation

Abstract