Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Der intrazelluläre bakterielle Erreger Chlamydia trachomatis durchläuft einen Entwicklungszyklus, der aus zwei morphologisch diskreten Entwicklungsformen besteht. Der nicht-reproduzierende Elementarkörper (EB) initiiert eine Infektion des Wirts. Einmal im Inneren, unterscheidet sich der EB in den Retikulatkörper (RB). Die RB durchläuft dann mehrere Replikationsrunden, bevor sie sich wieder auf die infektiöse EB-Form unterscheidet. Dieser Zyklus ist für das Überleben der Chlamydien von entscheidender Bedeutung, da das Nichtumschalten des Wechsels zwischen Zelltypen eine Hostinvasion oder Replikation verhindert.

Einschränkungen in genetischen Techniken aufgrund der obligaten intrazellulären Natur von Chlamydien haben die Identifizierung der molekularen Mechanismen behindert, die an der Zelltypentwicklung beteiligt sind. Wir haben ein neuartiges Dual-Promoter-Reporter-Plasmidsystem entwickelt, das in Verbindung mit der Live-Zellmikroskopie die Visualisierung des Zelltypwechsels in Echtzeit ermöglicht. Um Gene zu identifizieren, die an der Regulierung der Zelltypentwicklung beteiligt sind, wurde das Live-Zell-Promotor-Reporter-System für die Entwicklung eines vorwärtsgenetischen Ansatzes genutzt, indem chemische Mutagenese des Dual-Reporter-Stamms, Bildgebung und Verfolgung von Chlamydien mit veränderter Entwicklungskinetik kombiniert wurden, gefolgt von klonaler Isolierung von Mutanten. Dieser vorwärtsgenetische Workflow ist ein flexibles Werkzeug, das für gezielte Verhöre in eine Vielzahl von genetischen Pfaden modifiziert werden kann.