Rilevamento di DNA privo di cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici

Identificare le mutazioni nei tumori dei pazienti oncologici è un passo molto importante nella gestione delle malattie. Queste mutazioni fungono da biomarcatori per la diagnosi del tumore, nonché per la selezione del trattamento e la sua risposta nei pazienti oncologici. L'attuale metodo gold standard per rilevare le mutazioni tumorali comporta un test genetico del DNA tumorale attraverso biopsie tumorali. Tuttavia, questo metodo invasivo è difficile da eseguire ripetutamente come test di follow-up del repertorio mutazionale tumorale. La biopsia liquida è una tecnica nuova ed emergente per rilevare le mutazioni tumorali come approccio di biopsia facile da usare e non invasivo.

Le cellule tumorali si moltiplicano rapidamente. In parallelo, numerose cellule tumorali subiscono l'apoptosi. I detriti di queste cellule vengono rilasciati nel sistema circolatorio di un paziente, insieme a pezzi di DNA finemente frammentati, chiamati frammenti di DNA senza cellule (cfDNA), che portano mutazioni del DNA tumorale. Pertanto, per identificare i biomarcatori a base di CFDNA utilizzando la tecnica della biopsia liquida, i campioni di sangue vengono raccolti dai pazienti oncologici, seguiti dalla separazione del plasma e del mantello di buffy. Successivamente, il plasma viene elaborato per l'isolamento del cfDNA e il rispettivo strato di buffy viene elaborato per l'isolamento del DNA genomico di un paziente. Entrambi i campioni di acido nucleico vengono quindi controllati per verificarne la quantità e la qualità; e analizzato per le mutazioni utilizzando tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS).

In questo manoscritto, presentiamo un protocollo dettagliato per la biopsia liquida, tra cui la raccolta del sangue, la separazione del plasma e del mantello di buffy, l'estrazione del DNA cfDNA e germinale, la quantificazione del DNA cfDNA o germinale e l'analisi dell'arricchimento dei frammenti cfDNA.