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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, apresentamos um método para registrar respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento da retina (RPE) em camundongos usando uma técnica conhecida como DC-ERGs descrita pela primeira vez por Marmorstein, Peachey, e colegas no início dos anos 2000.

Abstract

O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada especializada de células estrategicamente localizadas entre a retina e os coriocapillaris que mantêm a saúde geral e a integridade estrutural dos fotorreceptores. O RPE é polarizado, exibindo receptores ou canais localizados apicamente e basally, e realiza transporte vetorial de água, íons, metabólitos e secreta várias citocinas.

As medidas in vivo não invasivas da função RPE podem ser feitas usando ERGs acoplados diretos (DC-ERGs). A metodologia por trás do DC-ERG foi pioneira por Marmorstein, Peachey, e colegas usando um sistema de gravação de estimulação personalizado e mais tarde demonstrou usando um sistema comercialmente disponível. A técnica DC-ERG usa capilares de vidro preenchidos com a solução de sal tampão (HBSS) de Hank para medir as respostas elétricas mais lentas do RPE provocadas a partir de mudanças de concentração evocadas pela luz no espaço subretinal devido à atividade do fotorreceptor. O estímulo de luz prolongado e o comprimento da gravação dc-ERG tornam-no vulnerável à deriva e ao ruído, resultando em um baixo rendimento de gravações de utilidade. Aqui, apresentamos um método rápido e confiável para melhorar a estabilidade das gravações, ao mesmo tempo em que reduzimos o ruído usando pressão de vácuo para reduzir/eliminar bolhas que resultam da eliminação do HBSS e do suporte de eletrodos. Além disso, os artefatos da linha de energia são atenuados usando um regulador de tensão/condicionador de energia. Incluímos os protocolos necessários de estimulação de luz para um sistema ERG comercialmente disponível, bem como scripts para análise dos componentes DC-ERG: onda c, oscilação rápida, pico de luz e resposta off. Devido à melhor facilidade de registros e ao fluxo de trabalho de análise rápida, este protocolo simplificado é particularmente útil na medição de mudanças relacionadas à idade na função RPE, progressão da doença e na avaliação da intervenção farmacológica.

Introduction

O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada de células especializadas que alinham o segmento posterior do olho e exercem funções críticas para manter a homeostase da retina1. O RPE suporta fotorreceptores regenerando seu pigmento visual captura de fótons em um processo chamado ciclo visual2, participando da fagocitose diurna das pontas do segmento externo do galpão3, e no transporte de nutrientes e produtos metabólicos entre fotorreceptores e os choriocapillaris4,5. Anormalidades na função RPE estão por trás de inúmeras doenças da....

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal descritas no protocolo de estudo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Olhos.

1. Importação de protocolos de estimulação de luz para DC-ERG

NOTA: Siga as instruções abaixo para importar os protocolos de estimulação de luz para o DC-ERG no software do sistema ERG (Tabela de Materiais). O protocolo consiste em um intervalo pré-estímulo de 0,5 min,.......

Representative Results

Figura 2 é um conjunto de dados de amostra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) e ratos do tipo selvagem (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ são camundongos com um nocaute condicional de microRNA 204 no epitélio pigmento da retina. Esses camundongos são gerados pela travessia de camundongos miR-204 floxed (produzidos pela NEIGEF)22 com ratos VMD2-CRE23. O MiR-204 é altamente expresso no RPE, onde regula a expressão de proteínas críticas para a.......

Discussion

Passos críticos

Uma boa gravação DC-ERG requer eletrodos estáveis que estão livres de bolhas que criam artefatos e deriva indesejada, pois são extremamente sensíveis à superagação e mudanças de temperatura. É essencial que uma linha de base estável seja alcançada quando os eletrodos são colocados na solução de banho HBSS antes de prosseguir com a gravação do mouse. Pequenas bolhas tendem a ser coletadas na base do eletrodo capilar ou ao redor da junta de sil.......

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por fundos intramuros do NEI. Os autores reconhecem sinceramente o Dr. Sheldon Miller por sua orientação científica, aconselhamento técnico e especialização em fisiologia e doenças RPE. Os autores agradecem a Megan Kopera e a equipe de cuidados com animais por gerenciar as colônias de ratos, e o Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou e Yuan Wang pelo apoio técnico.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl (mouth) ElectrodeWPI IncEP1Mouth reference electrode for mouse
Ceramic TileSutter InstrumentCTSUsed to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning StickPuritan Medical Products867-WC No GlueTo be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) SystemDiagnosys LLCE3 SystemVisual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen BurnerArgos TechnologiesBW20002460Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm)Sutter InstrumentsBF150-75For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific Inc14175-095Commercially available. Maintain at RT
In-Line FilterWhatman6722-5001To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode HoldersWPI Inc5372Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball JointWPI Inc500871For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLabMathworksMatLab: For editing the analysis software
Matlab Curvefit ToolboxMathworksToolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab CompilerMathworksToolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5MathworksR2018b (9.5)Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees)WPI IncMEH345-15For holding the capillaries
Needle (25 ga)Covidien8881250313For filling the capillary tubes with HBSS
needle (ground) electrodeRhythmlink13mm - one elctrodeSubdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power ConditionerFurmanP-1800Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL)Monoject1181200777For filling the capillary tubes with HBSS
T-clipCole-Parmer06852-20For electrode holder assembly
Vacuum DesiccatorBel-Art420120000Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gelAlcon0078-0429-47Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5%Akorn17478-201-15Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5%Akorn17478-263-12Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5%Akorn17478-101-12Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
XylazineAnaSedsc-362949RxAnalgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl)VetOne501072Anesthetic for intramuscular injections

References

  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mu....

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