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* These authors contributed equally
Aqui, apresentamos um método para registrar respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento da retina (RPE) em camundongos usando uma técnica conhecida como DC-ERGs descrita pela primeira vez por Marmorstein, Peachey, e colegas no início dos anos 2000.
O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada especializada de células estrategicamente localizadas entre a retina e os coriocapillaris que mantêm a saúde geral e a integridade estrutural dos fotorreceptores. O RPE é polarizado, exibindo receptores ou canais localizados apicamente e basally, e realiza transporte vetorial de água, íons, metabólitos e secreta várias citocinas.
As medidas in vivo não invasivas da função RPE podem ser feitas usando ERGs acoplados diretos (DC-ERGs). A metodologia por trás do DC-ERG foi pioneira por Marmorstein, Peachey, e colegas usando um sistema de gravação de estimulação personalizado e mais tarde demonstrou usando um sistema comercialmente disponível. A técnica DC-ERG usa capilares de vidro preenchidos com a solução de sal tampão (HBSS) de Hank para medir as respostas elétricas mais lentas do RPE provocadas a partir de mudanças de concentração evocadas pela luz no espaço subretinal devido à atividade do fotorreceptor. O estímulo de luz prolongado e o comprimento da gravação dc-ERG tornam-no vulnerável à deriva e ao ruído, resultando em um baixo rendimento de gravações de utilidade. Aqui, apresentamos um método rápido e confiável para melhorar a estabilidade das gravações, ao mesmo tempo em que reduzimos o ruído usando pressão de vácuo para reduzir/eliminar bolhas que resultam da eliminação do HBSS e do suporte de eletrodos. Além disso, os artefatos da linha de energia são atenuados usando um regulador de tensão/condicionador de energia. Incluímos os protocolos necessários de estimulação de luz para um sistema ERG comercialmente disponível, bem como scripts para análise dos componentes DC-ERG: onda c, oscilação rápida, pico de luz e resposta off. Devido à melhor facilidade de registros e ao fluxo de trabalho de análise rápida, este protocolo simplificado é particularmente útil na medição de mudanças relacionadas à idade na função RPE, progressão da doença e na avaliação da intervenção farmacológica.
O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada de células especializadas que alinham o segmento posterior do olho e exercem funções críticas para manter a homeostase da retina1. O RPE suporta fotorreceptores regenerando seu pigmento visual captura de fótons em um processo chamado ciclo visual2, participando da fagocitose diurna das pontas do segmento externo do galpão3, e no transporte de nutrientes e produtos metabólicos entre fotorreceptores e os choriocapillaris4,5. Anormalidades na função RPE estão por trás de inúmeras doenças da....
Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal descritas no protocolo de estudo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Olhos.
1. Importação de protocolos de estimulação de luz para DC-ERG
NOTA: Siga as instruções abaixo para importar os protocolos de estimulação de luz para o DC-ERG no software do sistema ERG (Tabela de Materiais). O protocolo consiste em um intervalo pré-estímulo de 0,5 min,.......
Figura 2 é um conjunto de dados de amostra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) e ratos do tipo selvagem (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ são camundongos com um nocaute condicional de microRNA 204 no epitélio pigmento da retina. Esses camundongos são gerados pela travessia de camundongos miR-204 floxed (produzidos pela NEIGEF)22 com ratos VMD2-CRE23. O MiR-204 é altamente expresso no RPE, onde regula a expressão de proteínas críticas para a.......
Passos críticos
Uma boa gravação DC-ERG requer eletrodos estáveis que estão livres de bolhas que criam artefatos e deriva indesejada, pois são extremamente sensíveis à superagação e mudanças de temperatura. É essencial que uma linha de base estável seja alcançada quando os eletrodos são colocados na solução de banho HBSS antes de prosseguir com a gravação do mouse. Pequenas bolhas tendem a ser coletadas na base do eletrodo capilar ou ao redor da junta de sil.......
Os autores não têm nada a revelar.
Este trabalho foi apoiado por fundos intramuros do NEI. Os autores reconhecem sinceramente o Dr. Sheldon Miller por sua orientação científica, aconselhamento técnico e especialização em fisiologia e doenças RPE. Os autores agradecem a Megan Kopera e a equipe de cuidados com animais por gerenciar as colônias de ratos, e o Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou e Yuan Wang pelo apoio técnico.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm - one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
Pharmacological treatment | |||
Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
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