Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Epithel-Organoid-Modelle dienen als wertvolle Werkzeuge, um die grundlegende Biologie eines Organsystems zu untersuchen und Krankheiten zu modellieren. Wenn sie als Organoide gezüchtet werden, können sich epitheliale Vorläuferzellen selbst erneuern und differenzierende Nachkommen erzeugen, die zelluläre Funktionen aufweisen, die denen ihrer In-vivo-Gegenstücke ähneln. Hierin beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um regionsspezifische Vorläufer aus der menschlichen Lunge zu isolieren und 3D-Organoidkulturen als experimentelles und validierendes Werkzeug zu generieren. Wir definieren proximale und distale Regionen der Lunge mit dem Ziel, regionsspezifische Vorläuferzellen zu isolieren. Wir nutzten eine Kombination aus enzymatischer und mechanischer Dissoziation, um Gesamtzellen aus Höhle und Luftröhre zu isolieren. Spezifische Vorläuferzellen wurden dann aus den proximalen oder distalen Ursprungszellen mittels fluoreszenzassoziierter Zellsortierung (FACS) auf der Grundlage von zelltypspezifischen Oberflächenmarkern wie NGFR für die Sortierung von Basalzellen und HTII-280 für die Sortierung von alveolären Typ-II-Zellen fraktioniert. Isolierte basale oder alveoläre Typ-II-Vorläufer wurden verwendet, um 3D-Organoidkulturen zu erzeugen. Sowohl distale als auch proximale Vorläufer bildeten Organoide mit einer koloniebildenden Effizienz von 9-13% in der distalen Region und 7-10% in der proximalen Region, wenn sie am 30. Tag 5000 Zellen / Well plattiert wurden. Distale Organoide hielten HTII-280⁺ alveoläre Typ-II-Zellen in Kultur, während proximale Organoide bis zum 30. Tag in flimmer- und sekretorische Zellen differenzierten. Diese 3D-Organoidkulturen können als experimentelles Werkzeug zur Untersuchung der Zellbiologie von Lungenepithel- und epithelialen mesenchymalen Interaktionen sowie für die Entwicklung und Validierung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung der epithelialen Dysfunktion bei einer Krankheit verwendet werden.