We bedanken de Vijayanand-lableden voor technische hulp en constructieve discussies en Dr. Sharron Squazzo en mr. Geoffrey Berguet van Diagenode voor technische assistentie met de sonicator en ChIP vloeistofbehandelingsmachine en protocollen. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) en S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).

De Institutional Review Board (IRB) van het La Jolla Institute for Allergy and Immunology (LJI; IRB protocol nr. SGE-121-0714) keurde de studie goed. Gezonde vrijwilligers werden gerekruteerd en verstrekten leukaferesemonsters na schriftelijke geïnformeerde toestemming.
1. Celfixatie
<ol><li>Breng de celsuspensieconcentratie op 1 tot 2 x10 6 cellen / ml met volledig celkweekmedium in een buis van 15 ml (<10 ml suspensie) of 50 ml buis (10-30 ml cellen). Als <1 x 106 cellen, gebruik dan 0,5 ml van het medium in een buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Draai de celsuspensie voorzichtig, voeg 10x celfixatiebuffer druppelsgewijs toe (1:10; vol:vol) en draai met een lage snelheid gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Stop de reactie door voorzichtig te vortexen en voeg 2,5 M glycine toe in de verhouding 1:20 (vol:vol). Keer de buizen een paar keer om en incubeer minstens 5 minuten op ijs.</li>
	<li>Voer de resterende stappen uit bij 4 °C of op ijs. Draai de buisjes gedurende 5 minuten bij 4 °C op 800 x g en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Resuspend de pellet voorzichtig met 5 ml ijskoude 1x PBS en incubeer gedurende 2 minuten op ijs.</li>
	<li>Herhaal 1,4 en 1,5 met 1 ml ijskoude 1x PBS en breng het monster over naar een voorgekoelde buis van 1,5 ml (gelabeld voor langdurige opslag). Indien van toepassing wordt de bereiding van aliquots aanbevolen.</li>
	<li>Draai de buisjes op 1.200 x g bij 4 °C en verwijder zoveel mogelijk van het supernatant zonder de celkorrel te verstoren. Vries de pellet in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 °C. LET OP: Neem de juiste bescherming bij het hanteren van vloeibare stikstof.</li>
</ol>2. Chromatine scheren
OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor het chromatine afschuiven van pellets met 0,3 tot 3 x 106 cellen in 0,65 ml laagbindende buizen.
<ol><li>Verwijder de monsterbuis met bevroren celkorrels vanaf -80 °C en bewaar op droogijs om ontdooien van de pellet te voorkomen voordat de lysisbuffer wordt toegevoegd. Deze stap is van cruciaal belang.</li>
	<li>Voeg 70 μL verse, RT complete lysisbuffer toe aan de pellet en houd 1 minuut bij RT.</li>
	<li>Resuspend de pellet gedurende 1 minuut zonder dat er bubbels ingebracht worden en incubeer vervolgens de celsuspensie bij RT gedurende 1 minuut voordat u het monster op ijs legt.</li>
	<li>Breng de geresuspendeerde pellet over in een laagbindende buis van 0,65 ml en houd op ijs. OPMERKING: Om reproduceerbare ultrasoonapparaat te verkrijgen, verwarmt u de sonicator vooraf door deze gedurende 3-6 cycli met alleen lege buizen te laten draaien voordat de monsters worden gesoniseerd.</li>
	<li>Plaats de monsters in de buishouder van de sonicator en vul eventuele openingen op met balansbuizen gevuld met 70 μL water. Laat de monsters ongeveer 1 minuut in het waterbad liggen voordat u met de ultrasoonapparaat begint.</li>
	<li>Voer ultrasoonapparaat uit voor x-cycli (afhankelijk van het celtype) met 16 s AAN / 32 s UIT per cyclus. OPMERKING: Deze stap vereist validatie-experimenten om het optimale aantal cycli te bepalen voor efficiënte ultrasoonapparaat.</li>
	<li>Verwijder na elke 3 cycli de monsters uit de sonicator, draai voorzichtig en puls de buizen voordat u ze terug in de houder plaatst. Zorg ervoor dat er geen kleine druppeltjes aan de buitenkant van de buis zitten, want dat kan bubbelvorming veroorzaken.</li>
	<li>Na het voltooien van de benodigde cycli, spin monsters met >14.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over naar een nieuwe, voorgekoelde, laagbindende laagbindende buis van 0,65 ml en blijf op ijs.</li>
	<li>Decrosslink een fractie van de gesonificeerde monsters om te controleren op de ultrasoonapparaatefficiëntie.<ol>
<li>Breng 1-7 μL van het supernatant (overeenkomend met ongeveer 250 ng geschoren chromatine) over naar een PCR-buis van 0,2 ml en maak het volume tot 10 μL met kortdurende lysisbuffer bij RT.</li>
		<li>Voeg 1 μL RNase A toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C bij 800 tpm en voeg vervolgens 1 μL proteïnase K toe.</li>
		<li>Incubeer gedurende 2 uur bij 55 °C met schudden bij 1.000 tpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder 2 μL van het gedecrosslinkte monster voor DNA-kwantificering met behulp van fluorescerende kwantificeringstest10 (een spectrofotometer wordt niet aanbevolen omdat zeep en afgebroken eiwit vertekening in de resultaten kunnen veroorzaken).</li>
	<li>Voer het resterende monster uit op een 1,2% agarosegel gedurende 1 uur bij 70 V. Kleur met nucleïnezuurkleurstof (1:20.000) en lees de gel af met een UV-transilluminator.</li>
	<li>Bereid chromatinevoorraad aliquots voor opslag (verdun het monster tot 25 ng/μL in 20 μL met volledige lysisbuffer). Bewaar alle afgeknipte chromatine bij -80 °C.</li>
</ol>3. Geautomatiseerde ChIP-Seq voor histonmodificatie
OPMERKING: Dit protocol is ontworpen om te worden uitgevoerd op een ChIP-vloeistofhandler. Hoewel het systeem aangepaste buffers kan gebruiken, worden alle buffers geleverd met de ChIP-kit. De ChIP-strips met 8 buizen die in deze sectie worden gebruikt, zijn specifiek voor de ChIP-vloeistofbehandelingsmachine.
<ol><li>Breng 16 aliquots met 500 ng geschoren chromatine over in 20 μL van -80 °C en leg ze op ijs om het chromatine langzaam te ontdooien. Eenmaal volledig ontdooid, vortex kort en pulse-spin.</li>
	<li>Bereiding van chromatine<ol>
<li>Pipetteer 100 μL tC1 buffer aangevuld met 1x proteaseremmer en 20 mM natriumbutyraat (complete tC1 buffer) in twee ChIP 8-buis strips.</li>
		<li>Breng 20 μL van elk chromatinemonster over in een geschikte buis van de ChIP 8-buisstrips met de 100 μL volledige tC1-buffer. Was de chromatinebuizen door 80 μL volledige tC1-buffer toe te voegen aan de chromatinebuizen en breng vervolgens terug in de juiste buis van de ChIP 8-buisstrips voor een eindvolume van 200 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van het antilichaam<ol>
<li>Bereken het volume van het antilichaam zodanig dat 0,5 μg antilichaam zich in elke buis bevindt. Volume antilichaam = (aantal monsters x antilichaam per reactie) / antilichaamconcentratie
</li>
		<li>Voeg de berekende hoeveelheid antilichaam toe aan 500 μL tBW1-buffer. Snel vortex en pulse-spin.</li>
		<li>Pipetteer 70 μL tBW1 in elk van de twee ChIP 8-buisstrips en voeg 30 μL van het antilichaam + tBW1 toe aan elk van de buizen. Dit brengt het totale volume in elk van de buizen op 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van de magnetische kraal<ol>
<li>Vortex het eiwit A-kraaloplossing grondig. Pipetteer voor 0,5 μg antilichaam 5 μL kralen in een nieuwe set ChIP 8-buisstrips en pulsspin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vul de laatste rij van de ChIP vloeistofbehandelingskast met gelabelde, lege ChIP 8-buis strips.</li>
	<li>Volg de ChIP-16-IPure-200D programmaspecificaties voor de plaatsing van alle strips in de ChIP vloeistofbehandelingsmachine. Voeg de buffers in de juiste positie toe, maar gebruik tW4 in plaats van tE1-buffer. OPMERKING: Organiseer de dag zodanig dat de ChIP-vloeistofhandler de ChIP 's nachts zal uitvoeren. Het programma loopt ongeveer 16 uur voor 16 monsters. Dit markeert het einde van dag 1.</li>
</ol>4. Transposase integratie van bibliotheekadapters voor bibliotheekvoorbereiding
<ol><li>Stel een thermomixer vooraf in op 37 °C en 500 tpm. Koel een magneet af voor 0,2 ml buisstrips op ijs.</li>
	<li>Bereid voor 16 monsters 440 μL tagmentatiebuffer op ijs. Pipetteer 53 μL in een enkele nieuwe 8-buiss strip en houd op ijs.</li>
	<li>Voeg in een nieuwe 0,2 ml 8-buisstrip 220 μL koude tC1-buffer toe en houd op ijs. De 8 stripbuizen kunnen dit volume vasthouden en toch worden afgedekt.</li>
	<li>Verwijder de stripbuis "IP-monsters" uit de ChIP-vloeistofbehandelingsmachine (rij 12) en sluit de buizen af voordat de puls wordt gedraaid. Vang de kralen op met behulp van de magneet voor 8-buis strips gedurende 2 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant.</li>
	<li>Breng 25 μL van de tagmentatiebuffer over op de kralen met een meerkanaalskanaal, verwijder uit de magneet en meng voorzichtig totdat de kralen homogeen zijn (ongeveer 5 keer op en neer met de pipet ingesteld op 20 μL).</li>
	<li>Sluit de buizen af en plaats in de voorverwarmde thermomixer en incubeer gedurende 3 minuten. Het verhogen van de tijd zal de efficiëntie van de bibliotheekvoorbereiding verminderen.</li>
	<li>Breng de buizen over in een gekoeld metalen rek en voeg 100 μL gekoelde tC1-buffer toe aan elk monster. Stel een meerkanaalspipet in op 80 μL en meng het monster totdat de kralen homogeen zijn, waardoor de tagmentatiereactie wordt gestopt.</li>
	<li>Plaats de monsters terug in de ChIP-vloeistofbehandelingsmachine en ga verder met de wasprocedure Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. Zorg ervoor dat het wassen twee keer wordt uitgevoerd met tC1-buffer en twee keer met tW4. De elutie moet worden voltooid zoals aangegeven door de lay-out van het programma, met buffer tE1.</li>
	<li>Decrosslinking van het DNA<ol>
<li>Verwijder de ChIP 8-buisstrips in de laatste rij van de ChIP-vloeistofbehandelingskast en voeg 2 μL RNase A toe aan elk monster.</li>
		<li>Dop de buizen, pulsspin, meng de kralen voorzichtig met een meerkanaalspipet tot het mengsel homogeen is en sluit de buizen opnieuw af.</li>
		<li>Incubeer de monsters in een thermomixer gedurende 30 minuten bij 37 °C en 900 tpm.</li>
		<li>Verwijder de monsters uit de thermomixer, voeg 2 μL Proteinase K toe. Volg na de toevoeging dezelfde procedure als 4.9.2.</li>
		<li>Incubeer de monsters in een thermomixer gedurende 4 uur bij 55 °C en 1.250 tpm, gevolgd door 65 °C bij 1.000 tpm gedurende de nacht. OPMERKING: Dit is het einde van dag 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gelabelde DNA-fragmenten zuivering
<ol><li>Label zestien buisjes van 1,5 ml met het juiste monsternummer en voeg 400 μL DNA-bindingsbuffer uit de DNA-opruimkit toe aan elk.</li>
	<li>Verwijder de strips met 8 buizen uit de thermomixer en draai de strips om ervoor te zorgen dat elk verdampt product behouden blijft. Plaats strips op een 8-strip magneet om de kralen op te vangen.</li>
	<li>Breng 100 μL gedecrosslinkt DNA over in elk van de 1,5 ml buisjes. Voeg 100 μL van de DNA-bindingsbuffer toe aan de strips met 8 buizen om de kralen te wassen en breng vervolgens over naar de juiste buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Vortex voor ongeveer 10 s en pulse-spin de 1,5 ml buizen.</li>
	<li>Laad de kolommen met de 600 μL die de DNA-bindingsbuffer en het ChIP-monster bevat.</li>
	<li>Spin monsters gedurende 20 s bij 10.000 x g en laad de kolom opnieuw met de doorstroom. Draai opnieuw onder dezelfde omstandigheden en gooi de doorstroming weg.</li>
	<li>Was de kolommen tweemaal met een wasbuffer van 200 μL (dezelfde centrifugering als de vorige stap) en gooi de doorstroming weg.</li>
	<li>Droog de kolommen door 2 min te centrifugeren op 12.000 x g.</li>
	<li>Breng de kolom over naar een nieuwe opvangbuis van 1,5 ml en voeg 9 μL warme TE Buffer (voorverwarmd tot 55 °C) rechtstreeks toe aan de kolommatrix. Laat de kolom 1 minuut incuberen voordat u 1 minuut centrifugeert bij 10.000 x g.</li>
	<li>Breng de 9 μL van de eluut over in een geschikte nieuwe set strips met 8 buizen.</li>
	<li>Vul de elutie opnieuw aan met 8 μL TE Buffer zoals voorheen. Breng het eluut over in de juiste stroken met 8 buizen (eindvolume 17 μL per monster) en bewaar het op ijs.</li>
</ol>6. Versterking en grootteselectie van de gezuiverde monsters
<ol><li>De volgende stappen gebruiken qPCR om het aantal cycli te bepalen dat nodig is voor optimale versterking (CtD - Ct-bepaling)</li>
	<li>Bereid de CtD-mix voor alle monsters door de inhoud van de CtD-mixbuffer te vermenigvuldigen met het aantal monsters.</li>
	<li>Doseer 3,6 μL CtD-mix in een qPCR-plaat en voeg 1,4 μL getagde DNA-monsters toe (~ 10% van het totale volume). Voer de volgende qPCR uit: 98 °C gedurende 3 minuten, 72 °C gedurende 5 minuten, 98 °C gedurende 30 s, 26 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 63 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s.</li>
	<li>Bereid de Amp Mix voor alle monsters door de inhoud van de AMP Mix Buffer te vermenigvuldigen met het aantal samples. Doseer 14 μL gelabeld DNA in afzonderlijke putjes van een PCR-plaat en voeg vervolgens 2,5 μL van twee sequencing indexprimers (25 μM) toe aan elk monster (het uiteindelijke reactievolume is 50 μL).</li>
	<li>Meng de monsters met een meerkanaalspipet en voer het versterkingsprogramma uit dat in de CtD wordt gebruikt met het juiste aantal cycli. OPMERKING: Dit is een goed stoppunt omdat de versterkte monsters een paar weken bij -20 °C kunnen worden bewaard. De zuivering kan echter op dezelfde dag worden voltooid. Voor 48 monsters werden de stappen 3 - 6.5 voltooid met twee andere afzonderlijke batches en vervolgens versterkt in één batch zoals hieronder beschreven.</li>
	<li>Voer post-amplificatie, grootteselectie en kwantificering van getagd DNA uit zoals hieronder beschreven. Dit kan meestal worden aangevuld met 48 monsters (kan naar wens met minder monsters worden aangevuld).<ol>
<li>Voeg 90 μL paramagnetische kralen (1:1,8 verhouding) toe aan elke put, meng en laat het 2 minuten incuberen bij RT.</li>
		<li>Vang de kralen op met een plaatmagneet en gooi het supernatant weg. Was de kralen 3 keer met 200 μL verse 80% ethanol zonder de kraalkorrel te verstoren.</li>
		<li>Verwijder overtollige ethanol met 20 μL tips na de laatste wasbeurt en laat de kralen 10 minuten drogen of totdat er scheuren in de kralenkorrels verschijnen.</li>
		<li>Terwijl de plaat nog op de magneet zit, voeg je 40 μL van het voorverwarmde water toe aan elke put. Sluit de plaat af, vortex grondig en puls de plaat kort.</li>
		<li>Vang de kralen op door de plaat terug op de magneet te plaatsen en breng de 40 μL eluut over naar een nieuwe "monster" plaat. De monsters worden nu gezuiverd en de volgende stappen verrijken fragmenten variërend van 200-1.000 bp.</li>
		<li>Optionele QC-stap: Verwijder 4 μL uit de monsters en breng over naar een QC-plaat. Voeg 4 μL water terug aan de monsters. Dit bepaalt het percentage grote fragmenten.</li>
		<li>Voeg 22 μL paramagnetische kralen (1:0,55 verhouding) toe aan de monsters, meng voorzichtig en incubeer bij RT gedurende 2 minuten.</li>
		<li>Plaats op de magneet om de kralen gedurende 5 minuten te vangen en breng de supernatanten over naar kolommen 7-12 van de "monster" -plaat. Verwijder de plaat van de magneet en voeg 30 μL kralen toe (eindverhouding van 1:1,3). Meng voorzichtig en laat het 2 minuten op RT zitten.</li>
		<li>Vang de kralen gedurende 5 minuten en gooi het supernatant dan weg.</li>
		<li>Was alle kralen 3 keer met 200 μL vers 80 % ethanol zoals eerder beschreven (stap 6.6.2 – 6.6.3).</li>
		<li>Zodra de pellets droog zijn, elueert u DNA met 8 μL voorverwarmde TE-buffer naar elke put, terwijl u nog steeds op de magneet zit.</li>
		<li>Verwijder de plaat van de magneet, sluit af en vortex grondig af. Laat de plaat 2 minuten incuberen bij RT, pulse-spin, en plaats de plaat gedurende 2 minuten terug op de magneet. Breng het supernatant over op een nieuwe plaat (plaat 2).</li>
		<li>Herhaal voor maximaal herstel de elutie met een extra 8 μL voorverwarmde TE-buffer. Plaats de monsters in de juiste putjes, zodat elk monster 16 μL eindbibliotheek heeft. OPMERKING: Aan het einde van deze stap moeten er twee platen zijn (één als er geen QC-plaat is voltooid). De QC-plaat heeft de vooraf geselecteerde fragmenten en de tweede plaat moet 48 putjes van de uiteindelijke bibliotheek hebben (16 μL totaal).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Kwantificeer de uiteindelijke bibliotheken en QC-monsters met behulp van een fluorescentietest
<ol><li>Volledige DNA-kwantificering met behulp van een fluorescentiekwantificeringstest of een vergelijkbare methode.</li>
	<li>Als de QC-kwantificering is voltooid, bepaalt u het percentage van het verlies van de steekproef dat werd < 1.000 bp. Er zou niet meer dan ongeveer 20% verlies moeten zijn - als er meer was, zou er een probleem kunnen zijn met de toegepaste kraalverhoudingen.</li>
	<li>Bepaal de grootte van de fragmenten van elk monster, bij voorkeur met behulp van een capillaire elektroforesemachine. Om de molaire concentratie te berekenen, gebruikt u de volgende vergelijking: [Bibliotheekconcentratie (ng/μL) * 106]/[660 * Mediane fragmentgrootte (bp)]). OPMERKING: De bibliotheken zijn klaar om te worden samengevoegd (equimolaire hoeveelheden) en gesequenced volgens standaard sequencingprocedures van de volgende generatie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Mapping+of+in+Vivo+Protein-DNA+Interactions.">Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Mikkelsen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+maps+of+chromatin+state+in+pluripotent+and+lineage-committed+cells.">Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells.</a> Nature. 448 (7153), 553-560 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Seumois, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+analysis+of+primary+human+T+cells+reveals+enhancers+associated+with+TH2+memory+cell+differentiation+and+asthma+susceptibility.">Epigenomic analysis of primary human T cells reveals enhancers associated with TH2 memory cell differentiation and asthma susceptibility.</a> Nature Immunology. 15 (8), 777-788 (2014).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17q21+asthma-risk+variants+switch+CTCF+binding+and+regulate+IL-2+production+by+T+cells.">17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells.</a> Nature Communication. 7, 13426 (2016).</li><li>Ai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+chromatin+states+using+single-cell+itChIP-seq.">Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1164-1172 (2019).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communication. 6, 6033 (2015).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 1930 (1930).</li><li>Youhanna Jankeel, D., Cayford, J., Schmiedel, B. J., Vijayanand, P., Seumois, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+and+Semiautomated+Microscaled+Approach+to+Profile+Cis-Regulatory+Elements+by+Histone+Modification+ChIP-Seq+for+Large-Scale+Epigenetic+Studies.">An Integrated and Semiautomated Microscaled Approach to Profile Cis-Regulatory Elements by Histone Modification ChIP-Seq for Large-Scale Epigenetic Studies.</a> Methods Molecular Biology. 1799, 303-326 (2018).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> Elife. 6, 21856 (2017).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Genetic+Polymorphisms+on+Human+Immune+Cell+Gene+Expression.">Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression.</a> Cell. 175 (6), 1701-1715 (2018).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drivers+of+Epigenetic+and+Transcriptional+Variation+in+Human+Immune+Cells.">Genetic Drivers of Epigenetic and Transcriptional Variation in Human Immune Cells.</a> Cell. 167 (5), 1398-1414 (2016).</li><li>Lienhard, M., Grimm, C., Morkel, M., Herwig, R., Chavez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEDIPS:+genome-wide+differential+coverage+analysis+of+sequencing+data+derived+from+DNA+enrichment+experiments.">MEDIPS: genome-wide differential coverage analysis of sequencing data derived from DNA enrichment experiments.</a> Bioinformatics. 30 (2), 284-286 (2014).</li><li>Engel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate-like+functions+of+natural+killer+T+cell+subsets+result+from+highly+divergent+gene+programs.">Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergent gene programs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 728-739 (2016).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoBATCH+for+High-Throughput+Single-Cell+Epigenomic+Profiling.">CoBATCH for High-Throughput Single-Cell Epigenomic Profiling.</a> Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li><li>Diagenode. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ultimate+Guide+for+Chromatin+Shearing+Optimization+with+Bioruptor+Standard+and+Plus.">The Ultimate Guide for Chromatin Shearing Optimization with Bioruptor Standard and Plus.</a> Diagenode. , (2012).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode breidt de ChIPmentation-procedure11uit, die een tagmentatiebibliotheekvoorbereidingsprotocol implementeert voorafgaand aan DNA-zuivering, door het protocol te automatiseren en te microscalen. Sinds het begin van ChIP-Seq zijn de vereiste celaantallen drastisch verminderd, van ongeveer 20 miljoen cellen voor histonen tot honderden en zelfs enkele cellen1,7,10, 12,18,19,20,21. Deze nieuw ontwikkelde methoden hebben een dieper begrip mogelijk gemaakt van hoe cis-regulerende mechanismen in cellen werken door de gevoeligheid te verhogen en zeldzame klinische celpopulaties te testen5,6,12,17. Bijvoorbeeld, een van de meer recente en populaire procedure, genaamd CUT & TAG, als robuust en gevoelig ChIP-Seq alternatief9. Het produceert een uitstekende signaal-ruisverhouding omdat het Tn5-enzym covalent gebonden is aan eiwit A en de Fc-keten van het ChIP-antilichaam met hoge specificiteit herkent9. Achtergrondactiviteit van Tn5-enzym is verminderd omdat het enzym niet functioneel is voordat het zich bindt aan het doelantilichaam9. De implementatie van deze methode in een klinische context is echter beperkt omdat er niet-vaste, levende cellen voor nodig zijn. Ook kan het verwijderen van DNA-fragmenten uit de hypotone kern negatieve effecten hebben op het chromatine omdat het tijdens de test wordt verwijderd. De noodzakelijke vereiste om met verse en levende cellen te werken, is een bron van problemen voor zeldzame klinische monsters en voor grote cohorten van monsters, omdat grote cohorten vele jaren kunnen duren om5te verzamelen . Een ander type methode, drop-ChIP, maakt elegant gebruik van een microfluïdica-apparaat om druppelgebaseerde tagmention te genereren voordat de ChIP19 wordt verwerkt. Het maakt echter gebruik van een zeer gespecialiseerd microfluïdisch apparaat en hoewel het mogelijk is om eencellige ChIP-Seq te voltooien, is het ook beperkt tot het gebruik van levende cellen7,8,9,18,19. Nieuwere methoden die vertrouwen op ChIP-Seq, zoals PLAC-Seq of HiChIP, proberen 3-dimensie (3D) interacties tussen de ChIP-Seq pieken22,23te begrijpen. Deze 3D-methoden zijn opwindend omdat ze cis-regulerendeof TF-gemedieerde interacties in het genoom identificeren en een beter begrip van de regulatie van genexpressie in celtypen van belang, in gezonde weefsels en in de context van ziekte.
Er zijn een paar kritieke stappen om te overwegen om het protocol succesvol te laten zijn, zoals de kwaliteit van het gesonificeerde chromatine en de kwaliteit van het antilichaam. De efficiëntie van het scheren is van cruciaal belang, als het chromatine niet goed wordt gesoniseerd, neemt de efficiëntie van de test drastisch af24. Sonicatie is een uitdagend aspect van ChIP-Seq vanwege de vereiste celnummers. Op de sonicator die in het protocol werd gebruikt, werd de efficiëntie drastisch verminderd tot minder dan 300.000 cellen. Dit is een uitdagend aspect in ChIP-Seq, omdat het ultrasoonapparaat onder dat niveau vaak enzymatische fragmentatie vereist, die minder onpartijdig is. Als gevolg hiervan is ultrasoonapparaat een belangrijke beperkte factor voor echte ChIP-Seq op microschaal. Andere ultrasoonapparaatplatforms en commercieel verkrijgbare kits werden getest voor het soniceren van chromatine, maar de sonicator die hier werd gebruikt, had de meest robuuste en reproduceerbare resultaten. Een ander voordeel van de sonicator is dat u geen gespecialiseerde buizen hoeft aan te schaffen om de ultrasoonapparaat uit te voeren, wat de kosten verlaagt bij het omgaan met een groot aantal monsters. Voor een optimale ultrasoonapparaat is het ten eerste belangrijk om de sonicator voor te verwarmen zoals hierboven beschreven. Ten tweede, om de pellet te lyseren, wordt het aanbevolen om de pipetpunt de bodem van de buis te laten raken terwijl je liegt om de cellen met meer fysieke beperkingen te breken. Ten derde belemmert elke bubbelvorming voorafgaand aan ultrasoonapparaat het vermogen van het monster om gelijkmatig te worden gesoniseerd. Als er tijdens de lysis bubbels worden gevormd, is het belangrijk om deze met een pipet te verwijderen. Dit kan een uitdaging zijn zonder veel monster te verwijderen, maar als de punt licht tegen de bel wordt gedrukt, kan deze langzaam worden opgesteld zonder verlies van veel monster. Ten slotte, bij het bepalen van het aantal cycli, voltooi een tijdsverloop waarbij elke drie cycli het monster wordt verwijderd, gezuiverd en op een agarose-gel wordt uitgevoerd. Vermijd over/onder ultrasoonapparaat van monsters, omdat dit de ChIP-efficiëntie vermindert. Als het monster te weinig sonicated is, kunnen de grote fragmenten een negatief effect hebben op de ChIP-Seq-kwaliteit24. Aan de andere kant, als het monster te veel sonicated is, bestaat het risico dat het doel-epitoop verloren gaat tijdens het proces.
Een ander essentieel onderdeel van ChIP-Seq is de kwaliteit van het antilichaam. Voordat een grootschalige studie wordt uitgevoerd, is het noodzakelijk om het antilichaam dat zal worden gebruikt te optimaliseren. Het doel is om een significant hoge signaal-ruisverhouding van bekende gebieden van het genoom te verkrijgen en een andere is de reproduceerbaarheid. Als het antilichaam veel achtergrondsignaal trekt, kan het worden aanbevolen om een grotere ingang te gebruiken of een andere partij / leverancier te proberen. Dit voegt tijd toe voordat een grootschalig experiment wordt gestart, maar het is een essentiële stap. Om te testen op het signaal-naar-ruis wordt aanbevolen om qPCR te gebruiken met regio's waarvan bekend is dat ze een doelwit van uw antilichaam zijn en een ander gebied waarvan bekend is dat het afwezig is. Het is opgemerkt dat histonmodificaties robuuster en gemakkelijker te optimaliseren zijn dan TF's.
Het hierboven beschreven protocol biedt een robuuste methode voor high-throughput histon-modificatie ChIP-Seq op een semi-autonome, microschaalachtige manier. De methode beperkt de hoeveelheid hands-on tijd en verhoogt de reproduceerbaarheid ten opzichte van handmatige ChIP-Seq. Eerdere studies voltooid in het laboratorium gebruikten handmatige ChIP op technische replicaties en verkregen een Spearman-correlatiegemiddelde van0,50 5,maar met het semi-geautomatiseerde systeem, de Spearman-correlatie tussen verschillende donoren met een NK-cellengemiddelde van 0,66(aanvullende tabel 2). Dit werd ook voltooid met ongeveer 40% minder hands-on tijd. De hier beschreven methode is geoptimaliseerd voor histon-modificaties (H3K27ac hier weergegeven, maar het protocol zou geen wijziging voor anderen nodig moeten hebben) en zou slechts kleine wijzigingen vereisen om te worden geïmplementeerd voor TF ChIP-Seq. Ondanks de kwaliteit van het antilichaam, zou de belangrijkste wijziging zijn voor de ultrasoonapparaattijd en mogelijk de buffers die tijdens het IP worden gebruikt. Meestal kan de methode voor TF ChIP-assays beter werken met iets langere fragmenten chromatine (met een bereik van ongeveer 350-800 bp) omdat TF: DNA-complexen waarschijnlijk minder goed kunnen worden onderhouden door rigoureuze ultrasoonapparaat6. De buffers moeten mogelijk ook worden gewijzigd in een aangepaste mix of andere door de industrie beschikbare kits, omdat TF's zich anders kunnen gedragen dan histonwijzigingen.
Hoewel de geautomatiseerde ChIP-vloeistofbehandelingsmachine werd getest op slechts 10.000 cellen, was er een merkbare afname van de reproduceerbaarheid bij lagere chromatineconcentraties. Daarom werd het protocol niet aanbevolen voor minder dan 10.000 cellen, waarbij 100.000 cellen de optimale omstandigheden waren. Het protocol werd ook voltooid met behulp van ChIP-buffers van de industrie, wat een extra kostenpost was, maar gegevens van hogere kwaliteit opleverde. Het protocol kan worden gewijzigd met betrekking tot de ultrasoonapparaatomstandigheden (zolang het afgeschoven chromatine binnen hetzelfde bereik wordt gehouden), buffers kunnen worden aangepast voor de immunoprecipitatie (IP; optimalisatie kan nodig zijn), of de ChIP-vloeistofhandler kan niet worden gebruikt. Een beperking van het protocol is het gebruik van de ChIP liquid-handler, wat een dure investering kan zijn en slechts 16 samples tegelijk kan uitvoeren. De ChIP vloeistof-handler is beperkt tot kleinschalige reacties en celaantallen groter dan een miljoen worden niet aanbevolen. Het protocol kan echter zonder worden voltooid, door de IP- en wasstappen handmatig te voltooien. Als het IP en de wasbeurten met de hand werden voltooid, zal de tijd om de test te voltooien toenemen en kan de reproduceerbaarheid afnemen, maar deze gids zal nog steeds nuttig zijn bij het uitvoeren van een hoogwaardig ChIP-Seq-experiment. Van belang is dat andere vloeistofhandlers kunnen worden aangepast om semi-geautomatiseerde ChIP-reacties uit te voeren.
Samenvattend zijn de belangrijkste voordelen van dit systeem het hoge doorvoerkarakter, omdat de IP- en wasstappen autonoom worden voltooid. Als zodanig kunnen opeenvolgende rondes van ChIP-experimenten worden voltooid, waardoor tot 48 monsters volledig kunnen worden verwerkt en klaar voor sequencing in 5 dagen, met beperkte hands-on tijd in vergelijking met handmatige ChIP-Seq-experimenten. Een ander voordeel is de verhoogde reproduceerbaarheid, omdat ChIP-Seq moeilijk kan zijn om zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Andere methoden vereisen ofwel levende cellen, complexe micropipetterssystemen of het werk dat allemaal met de hand moet worden voltooid. Dit systeem zal moeten worden geoptimaliseerd voor monsters met een lage input (< 10.000 cellen), waardoor uiteindelijk eencellige ChIP-reacties mogelijk worden. Het systeem kan ook worden aangepast voor de nieuwere ChIP-methoden, zoals PLAC-Seq en HiChIP22,23.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Pandurangan Vijayanad
to:
Pandurangan Vijayanand

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.

Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Sara Herrera-da&#160;la Mata
to:
Sara Herrera-de la Mata

Het brede gebruik van ChIP-Seq-assays voor het bepalen van DNA-fragmenten geassocieerd met specifieke histonmodificaties is deels te wijten aan het vermogen om cis-regulerende DNA-elementen te identificeren, waaronder actieve versterkers, promotors, geluiddempers, heterochromatine en anderen1,2,3,4. Identificatie van niet-coderende regulerende regio's in het genoom heeft waardevol inzicht opgeleverd om genregulatie in gezondheid en ziekten beter te begrijpen4. Eerder werk uit het lab heeft ChIP-Seq gebruikt om aan te tonen dat cis-regulerende elementen een belangrijke rol kunnen spelen in verschillende celtypen5. Transcriptiefactor (TF) ChIP-assays zijn gebruikt om ziektegerelateerde risico's van single-nucleotide polymorfismen aan te tonen6.
Het gebruik van ChIP-Seq met klinische monsters bij mensen is een uitdaging, voornamelijk vanwege de beperking van het aantal cellen of het gewenste weefselmonster. Als gevolg hiervan is er een gezamenlijke inspanning in het veld geweest om deze technieken te verbeteren en op microschaal te brengen en als gevolg daarvan zijn er verschillende testen ontstaan, zoals CUT & TAG5,7,8,9,10,11,12. Deze test maakt gebruik van een transposase om genomische gebieden te taggen en te isoleren die gebonden zijn door een specifiek antilichaam9. Deze techniek is in staat geweest om het aantal cellen te verminderen tot 1.000s en in sommige gevallen tot een eencellig, maar het gebruik van deze techniek in translationeel onderzoek en klinische opstelling heeft beperkingen laten zien als gevolg van de vereisten van het gebruik van levende cellen voor deze methode9,12. De vereiste levende cel maakt klinische monsters logistiek moeilijk te hanteren en kan batcheffecten introduceren als de monsters niet tegelijkertijd worden verwerkt. Anderen hebben geoptimaliseerde microschaaltechnieken voor formaldehyde-vaste cellen, waaronder de ontwikkeling van ChIPmentation11, die hier op een high-throughput manier wordt aangepast. Het gebruik van vaste cellen maakt het mogelijk om monsters op te slaan totdat alle monsters worden verzameld en vervolgens worden verwerkt om batcheffecten te minimaliseren.
Hier wordt een semi-geautomatiseerde microschaal ChIP-Seq-test beschreven die experimentele hands-on tijd verkort om histonmodificaties teprofileren 10. De semi-geautomatiseerde methode maakt chIP-seq-assays met hoge doorvoer mogelijk, waardoor tot 48 monsters volledig kunnen worden verwerkt en klaar zijn voor sequencing in slechts 5 dagen, voor slechts 10.000 cellen per monster met behulp van een ChIP-vloeistofhandler. De handler voltooit de immunoprecipitatie (IP) en de daaropvolgende wasbeurten op een autonome manier, wat helpt om de variabiliteit tussen monsters te verminderen. De semi-geautomatiseerde methode verlaagt zowel de hands-on tijd met meer dan 15 uur voor 48 monsters als de technische variabiliteit, waardoor grootschalige epigenetische studies op een reproduceerbare en snelle manier kunnen worden uitgevoerd voor primaire of gekweekte cellen. Het protocol legt het proces van begin tot eind uit voor chip-seq van hoge kwaliteit. Als de specifieke machines niet beschikbaar zijn, is het protocol nog steeds een nuttige bron om ChIP-Seq-experimenten handmatig in te stellen en problemen op te lossen.
De test werd uitgevoerd met drie verschillende primaire menselijke immuunceltypen en één gekweekte cellijn (HUT78 – ATCC: TIB-161). Voor de duidelijkheid is het protocol onderverdeeld in zeven secties: celfixatie, chromatine shearing via sonicatie, geautomatiseerde chromatine immunoprecipitatie, bibliotheekvoorbereiding door DNA-fragment tagmentatie, bibliotheekversterking, bibliotheekzuivering, gevolgd door DNA-kwantificering. Voor bufferrecepten verwijzen wij u naar aanvullende tabel 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="950">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">200 &#181;l tube strips (8 tubes/strip) + cap strips</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020002</td>
			<td style="width:288px;">Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">AMPure XP for PCR Purification</td>
			<td style="width:127px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>SPRI beads</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td>0.65 mL low binding tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Bioruptor Pico Sonicator</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B01060010</td>
			<td>Sonicator used in the lab but others can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ChIP DNA Clean &#38; Concentrator (Capped Columns)</td>
			<td style="width:127px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D5205</td>
			<td>DNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA pH 8.0</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Glycine</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">50046-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">H3K27ac polyclonal antibody - Premium</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15410196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES (1 M) pH 7.5</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20027213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20034197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IP-Star Compact Automated System</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B03000002</td>
			<td>Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">KK2601</td>
			<td>PCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">R0971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4551-250ML</td>
			<td>CAUTION - low flash point</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (5 M), RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-4700</td>
			<td style="width:288px;">8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PureLink RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td>Used in the flourescence quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">4485699</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ROX Reference Dye</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12223012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">303410-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td>nucleic acid dye</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Tips (bulk)</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30040020</td>
			<td>Tips for the IP Star</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">True MicroChIP Kit</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C01010130</td>
			<td>Contains all the buffers for the IP; ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24730020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies

Chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing (ChIP-Seq) is een krachtige en veelgebruikte benadering om chromatine-DNA te profileren geassocieerd met specifieke histonmodificaties, zoals H3K27ac, om cis-regulerende DNA-elementen te helpen identificeren. Het handmatige proces om een ChIP-Seq te voltooien is arbeidsintensief, technisch uitdagend en vereist vaak grote aantallen cellen (>100.000 cellen). De hier beschreven methode helpt om die uitdagingen te overwinnen. Een complete semi-geautomatiseerde, microschaal H3K27ac ChIP-Seq-procedure inclusief celfixatie, chromatine-afschuiving, immunoprecipitatie en sequencingbibliotheekvoorbereiding, voor batch van 48 monsters voor celnummerinvoeren van minder dan 100.000 cellen wordt in detail beschreven. Het semi-autonome platform vermindert de technische variabiliteit, verbetert de signaal-ruisverhoudingen en vermindert de arbeid drastisch. Het systeem kan daardoor de kosten verlagen door lagere reactievolumes mogelijk te maken, waardoor het aantal dure reagentia zoals enzymen, magnetische kralen, antilichamen en benodigde hands-on tijd wordt beperkt. Deze verbeteringen aan de ChIP-Seq-methode zijn perfect geschikt voor grootschalige epigenetische studies van klinische monsters met beperkte celaantallen op een zeer reproduceerbare manier.

Als proof of concept werd ChIP-Seq voltooid voor zes menselijke donoren met drie sets immuunceltypen: naïeve CD4 T-cellen (CD4), klassieke monocyten (MO) en natural killer-cellen (NK), verrijkt met FACS-sortering zoals beschreven vóór13. De onderstreepte procedure bestaat uit negen verschillende procedures zoals weergegeven in figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig1.jpg"> Figuur 1: Algemeen stroomdiagram voor de procedure. (A) Een cartoon van de algemene procedure (gegenereerd in BioRender). (B) Stroomdiagram voor alle belangrijke stappen voor het protocol en de geschatte hands-on en totale tijd die aan elke dag is gekoppeld. De volgorde kan gebeuren aan het einde van dag 5 of later met meerdere rondes. De tijdlijn kan ook over de week worden gespreid, waarbij opeenvolgende dag 3-4 meerdere keren per week kan worden voltooid om 48 ChIP-monsters te genereren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Na celisolatie door flowcytometrie13werden gesorteerde cellen gecentrifugeerd en cellen gefixeerd en opgeslagen zoals hierboven beschreven. Nadat alle monsters waren verzameld, werden de monsters gelyseerd en voorbereid voor chromatisch scheren in batches van 12 zoals hierboven beschreven. Voor elk monster werd het aantal cycli om optimale ultrasoonapparaat te bereiken voltooid10. Kwantitatieve metingen, evenals afgeschoven chromatinefragmentgroottemetingen toonden een grote reproduceerbaarheid van onze methode op de drie sets immuuncellen (Figuur 2A). De verschillende menselijke immuuncellen werden in afzonderlijke batches gesoniseerd en leverden zeer consistent op met > 70% van het monster tussen 100 - 500 bp gedurende 14 cycli (16 s AAN, 32 s UIT per cyclus). Op dit punt werden monsters met grote fragmenten na ultrasoonapparaat (< 70% van het monster tussen 100 - 500 bp) als mislukt beschouwd. Deze monsters konden 1-2 extra cycli worden gesoniseerd of werden weggegooid en later vervangen door cellen uit een andere pellet. Onze methode toonde aan dat geen van de monsters meer ultrasoonapparaat vereiste of werd geëlimineerd, wat de absolute robuustheid van de procedure suggereert.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig2.jpg"> Figuur 2: Pre-sequencing QC voorbeelden. (A) 1,2% agarose gels tonen reproduceerbaarheid van ultrasoonapparaat. Sonicatiemonsters voor 6 donoren in drie celtypen: naïeve CD4 T-cellen (CD4), klassieke monocyten (MO) en natural killer-cellen (NK). De monsters werden gedurende 14 cycli (16 s AAN, 32 s UIT per cyclus) gesoniseerd. Voor elk monster werd ongeveer 200 ng gedecrosslinkt chromatine geladen op een 1% agarose-gel. Monsters werden als goed beschouwd als meer dan 70% van de fragmenten zich binnen 100-500 bp bevinden. (B) Top - Analyse qPCR-versterkingscurven om het optimale aantal cycli voor versterking te bepalen (Ct waar er 1/2 van de maximale intensiteit is). De ideale monsters hebben een Ct van ongeveer 15 en versterking kan tot 2 cyclus meer van de gemeten Ct worden voltooid. De pijl is een voorbeeld van een slecht voorbeeld waarbij de Ct groter is dan 18. Bodem - Er wordt een voorbeeld getoond van een slechte set monsters die een Ct groter dan 18 hebben. Deze monsters vertoonden ook een lagere fluorescentie-intensiteit. (C) Links - Fragment analyzer elektroforese sporen toonden de verdeling van de uiteindelijke getagde bibliotheken na versterking en grootte-selectie. Monsters met meer dan 85% van de fragmentbibliotheek ligt binnen 200-1.000 bp werden beschouwd als goede monsters. Het meten van de piekintensiteit van fluorescentie wordt ook beschouwd als een belangrijke QC-parameter, inderdaad, als het signaal laag is, is het onwaarschijnlijk dat het monster goed zal sequencen. Rechts - Voorbeelden voor positieve monsters in CD4, MO en NK worden getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Na kwantificering werden de monsters uitgevoerd op een ChIP-vloeistofhandler met H3K27ac-antilichamen, gevolgd door tagmentatie met Tn5 transposase-enzym. Om het juiste aantal versterkingscycli per qPCR te bepalen, werd 10% van de getagde monsters gebruikt. Voor de bepaling van het aantal cycli voor de versterking van de monsters vinden we de cyclus waarbij de intensiteit van het monster de helft is van het gemiddelde maximum voor cyclusbepaling (figuur 2B). Monsters met Ct-waarden van meer dan 18 presteerden niet goed na sequencing en hun Ct-waarde was dus indicatief voor een mislukt ChIP-monster. Deze monsters leverden over het algemeen ook een lagere hoeveelheid DNA op na amplificatie. Monsters (100.000 cellen ingevoerd) met een Ct-waarde gelijk aan of kleiner dan 15 waren ideaal en monsters tussen 15 en 18 waren acceptabel maar minder consistent na sequencing. Voor monsters met minder dan 100.000 invoercellen werden de Ct-waarden meestal gevonden tussen 15 en 18, maar hadden ze niet meer dan 18 cycli nodig om voldoende product voor sequencing op te leveren.
Na DNA-gelabelde amplificatie werden bibliotheken gezuiverd en de grootte geselecteerd om een ideale grootteverdeling te verkrijgen, variërend van 200 tot 1.000 bp, voor de NextGen-sequencing. De beoordeling van de grootteverdeling op elk van de bibliotheken werd voltooid omdat de beste sequencinggegevens werden verkregen wanneer meer dan 85% van de DNA-fragmenten varieerde tussen 200 en 1.000 bp(figuur 2C). Met name omdat dezelfde hoeveelheid DNA (gemeten door fluorescentiekwantificering) werd geladen, werd opgemerkt dat de monsters met een lagere fluorescentie-intensiteit over het algemeen slecht werden gesequenced(figuur 2C).
Post sequencing, standaard kwaliteitscontroles op basis van de ENCODE ChIP-Seq richtlijnen werden toegepast5,14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig3.jpg"> Figuur 3: Reproduceerbaarheid van de immuuncelmonsters. (A)H3K27ac volgt (UCSC Genome Browser, maximale intensiteit, afvlakkingsfunctie van 4, allemaal met gelijk geschaalde Y-as) voor 6 donoren (100.000 cellen per replica) in elk celtype (CD4, MO en NK). Er worden vier voorbeeldige loci getoond, twee met (IL2RA locus en PTPRC) en twee zonder verrijking voor H3K27ac (CCR4 en MS4A1). (B) Pearson correlatie tussen de donoren en overeenkomstige correlatieplots gegenereerd met behulp van een 300 bp extensie en 500 bp venster binnen het MEDIPS pakket voor elk van de celtype repliceert16. (C)Samengevoegde donorbestanden voor elk celtype met H3K27ac-sporen (UCSC Genome Browser maximale intensiteit, afvlakkingsfunctie van 4) in celtypespecifieke regio's (IL17R voor CD4, CCR2 voor MO en KLRC1 voor NK) en het huishoudgen B2M, aanwezig in alle celtypen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Voor visuele kwaliteitscontrole werden H3K27ac-verrijkingssporen voorbereid voor weergave in de UCSC-genoombrowser. Voor vier genloci vertoonden individuele tracks voor elk monster een hoge mappingkwaliteit en signaal-ruisverhouding die de hoge consistentie en robuustheid van onze test weerspiegelt(Figuur 3A). De twee loci aan de linkerkant herbergen goed tot expressie gebrachte genen in deze celtypen, terwijl de genen in de twee loci aan de rechterkant niet tot expressie worden gebracht en dienen als achtergrondcontroles13 (Figuur 3A). Verder werd het MEDIPS-analysepakket gebruikt als post-sequencingvariabele om de correlatie-index tussen technische replicaties te beoordelen (Figuur 3B)5,16,17, waarbij de mate van correlatie voor leesverrijkingsniveau voor 500 bp-bakken16werd vastgesteld. Voor de meerderheid van de paarsgewijze vergelijkingen vertoonden Pearson-correlatie-indexen meer dan 90% correlatie, wat wijst op een hoge mate van consistentie tussen de biologische replicaties(figuur 3B). Replicaties met een acceptabele correlatie werden samengevoegd om de signaal-ruisverhouding te verhogen. Terwijl celtypespecifieke loci een hoge verrijking vertoonden in de juiste cellen, vertoonde een huishoudgen (B2M) een zeer consistente histonmodificatie(figuur 3C). Voor de analyse zal het samenvoegen van sporen van replicaties de verrijking verhogen, het specifieke signaal versterken, ook voor belangrijke celtypespecifieke versterkers, en de interindividuele variabiliteit verminderen die inherent is aan menselijke monsters5.
Hoewel 100.000 cellen werden gebruikt voor deze studie, was er een hoge reproduceerbaarheid voor slechts 10.000 cellen in een door de mens gekweekte T-cellijn (HUT78). Correlatieanalyse tussen ChIP-Seq dataset uitgevoerd uit monsters met minder dan 100.000 cellen toonde een hoge reproduceerbaarheid en correlatie tot 10.000 cellen(Figuur 4A).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig4.jpg"> Figuur 4: Reproduceerbaarheid van monsters met een lage input. (A) Voorbeelden van de consistentie van H3K27ac ChIP-Seq voor cellen 100.000 tot 10.000 in HUT-78 cellen (een T-cellymfoomcellijn). De tracks (UCSC Genome Browser, maximale intensiteit, afvlakkingsfunctie van 4, allemaal met gelijk geschaalde Y-as) tonen de IL4-locus. (B) Pearson correlaties van de replicaties met behulp van een 300 bp extensie en 500 bp venster binnen het MEDIPS pakket16.  (C) Pearson correlaties tussen de verschillende celnummergroepen (100.000, 50.000 en 10.000 cellen) met behulp van dezelfde MEDIPS parameters als in (B)16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Pearson correlatieanalyse toonde een hoge correlatie-index (83% tot 92%), wat suggereert dat het signaal in monsters met een laag celgetal wordt gehandhaafd. Er was echter een verhoogde achtergrond naarmate de celaantallen werden verminderd, evenals een daling van de correlatiecoëfficiënten (figuur 4B). Om lage achtergrondsignalen te behouden, werden technische duplicaten samengevoegd en werd de correlatie tussen groepen getest(figuur 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>10x cel fixatie buffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Verbinding</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Formaldehyde oplossing</td>
			<td>11%</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>100m</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8,0</td>
			<td>1mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA, pH 8,0</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES, pH 7,5</td>
			<td>50 meter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Complete Lysis Buffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Verbinding</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8,0</td>
			<td>50 meter</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8,0</td>
			<td>10 meter</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumbutyraat</td>
			<td>20 meter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteaseremmer Cocktail</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Korte termijn Lysis Buffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Verbinding</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8,0</td>
			<td>50 meter</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8,0</td>
			<td>10 meter</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tagmentatie Mix</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Verbinding</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8,0</td>
			<td>10 meter</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>5 meter</td>
		</tr>
<tr>
<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Illumina tagmentatie enzym</td>
			<td>1:24 vol:vol</td>
		</tr>
<tr>
<td>CtD-mix</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Verbinding</td>
			<td>Per monster (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Index Primer A (25 μM)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Index Primer B (25 μM)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td>
			<td>2.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>1:1000 SYBR Groene kleurstof</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>ROX passieve kleurstof</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Water</td>
			<td>Vul tot 4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>AMP-mix</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Verbinding</td>
			<td>Per monster (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td>
			<td>27.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Water</td>
			<td>Vul tot 31 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Aanvullende tabel 1: Bufferrecepten. 
Aanvullende tabel 2: Spearman en Pearson steekproef correlaties voor de 6 donoren en elk celtype. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/Supplementary_Table_2.xlsx">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Dit artikel beschrijft een semiautomatiseerd, microschaal ChIP-Seq-protocol van DNA-regio's geassocieerd met een specifieke histonmodificatie (H3K27ac) met behulp van een ChIP-vloeistofhandlerplatform, gevolgd door bibliotheekvoorbereiding met behulp van tagmentatie. De procedure omvat controlebeoordeling voor kwaliteits- en kwantiteitsdoeleinden en kan worden toegepast op andere histonmodificaties of transcriptiefactoren.

Een semiautomatiseerde ChIP-Seq-procedure voor grootschalige epigenetische studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

This protocol is significant in that it allows for high-throughput ChIP-Seq analysis of primary samples to better understand cis-regulatory mechanisms, and its implication on disease. The main advantages of this method are the reproducibility of the data, and the drastic reduction of hands-on lab time. For chromatin shearing, add 70 microliters of fresh, room-temperature, complete lysis buffer to a glycine-fixed, snap-frozen and thawed cell pellet of interest, for a one-minute incubation at room temperature, followed by one minute of resuspension without bubbles.Incubate the sample for another minute at room temperature, before placing the cells on ice. Transfer the resuspended pellet into a 0.65 milliliter low-binding tube on ice, before loading the tube onto the tube holder of a sonicator. Fill any gaps with balance tubes containing 70 microliters of water, and let the cells stabilize in the water bath for about one minute before starting the sonication.After three cycles, remove the samples from the sonicator for gentle vortexing, and pulse-spin the tubes before placing them back into the holder. For histone modification, add 100 microliters of complete tC1 buffer to each tube of two chip eight-tube strips, and transfer 20 microliters of each of 16 chromatin-shared samples into individual tubes of the chip eight-tube strips. Wash the chromatin tubes with 80 microliters complete tC1 buffer, and pool the washes in the appropriate tubes of the chip eight-tube strips for a final volume of 200 microliters of solution per tube.Add the appropriate volume of antibody to 500 microliters of TBW1 buffer, and quickly vortex, and pulse spin. Then add 70 microliters of tBW1, and 30 microliters of antibody solution to each tube of a new chip eight-tube strip. Next, thoroughly vortex a container of protein A bead solution, and add five microliters of beads per 0.5 micrograms of antibody to a new tube strip.Pulse spin the strip of beads, and fill the last row of the chip liquid handler with labeled, empty, chip eight-tube strips. Then follow the chip 16-I pure 200 D program specifications for the placement of the rest of the strips, and load the buffers into the correct positions. After sequencing, capture the beads in an eight-tube strip magnet, and transfer 25 microliters of tagmentation buffer to each tube.With the tubes removed from the magnet, mix gently, until the bead solutions are homogenous, before placing the re-capped tubes into a preheated ThermoMixer for three minutes. At the end of the incubation, remove the chip eight-tube strips in the last row of the chip liquid handler, and add two microliters Rnase A to each sample. Then pulse spin the re-capped tubes, and gently mix, until the bead solutions are homogenous.For a purification of the tagmented DNA fragments, transfer 100 microliters of the D cross-linked DNA samples into individual 1.5 milliliter tubes, and wash the tubes with 100 microliters of DNA binding buffer per tube. pulse the washes in the appropriate tubes, and load the samples onto columns. Place the columns into new 1.5 milliliter collection tubes, and add nine microliters of 55 degrees Celsius Tris-EDTA buffer directly to the column matrices.After one minute, centrifuge the columns, and transfer the nine microliters of eluate from each column into a new eight-tube strip on ice. Elute the DNA fragments again as demonstrated, but with eight microliters of Tris-EDTA buffer, and pool the eluate with the previously-harvested DNA fragment solution. To amplify the purified DNA fragment samples, mix the samples with a multi-channel pipette, and perform an amplification program with the appropriate number of cycles.After the amplification, use a plate magnet to capture the beads, and discard the supernatant. Wash the beads three times with 200 microliters of fresh 80%ethanol per wash, without disrupting the bead pellet. After the last wash, use a 20-microliter pipette tip to remove any excess ethanol, and allow the beads to dry for 10 minutes, or until cracks appear in the bead pellets.Add 40 microliters of pre-warmed water to each dried sample, and seal the plate before thoroughly vortexing, and briefly pulse spinning. Then quantify the DNA, using a fluorescence-quantifying assay, according to standard protocols. Sheared chromatin fragment size measurements demonstrate great reproducibility with greater than 70%of the samples being observed between 100 and 500 base pairs for 14 cycles.As illustrated, the cycle at which the intensity of the tagmented sample is half the average maximum is optimal for cycle determination. The best sequencing data are obtained when more than 85%of the DNA fragments range between 200 to 1000 base pairs. In these representative enrichment tracks for four gene loci, individual tracks for each sample show a high mapping quality, and signal-to-noise ratio.The first two loci harbor well-expressed genes in these cell types, while the genes in the last two loci are not expressed, and serve as background controls. For the majority of the pairwise comparisons, Pearson correlation indexes show more than a 90%correlation, suggesting a high level of consistency between the biological replicates. While cell type-specific loci exhibit a high enrichment in the appropriate cells, a housekeeping gene shows very consistent histone modification.Correlation analysis between ChIP-Seq dataset performed from samples with less than 100, 000 cells still demonstrate a high reproducibility and correlation down to 10, 000 cells. However, there is an increased background as the cell numbers are reduced, as well as a decrease in their correlation coefficients. Proper lysing of the cells is essential for generating high-quality data, as we have found that incomplete cell lysis affects the rest of the protocol.Using this method, many different histone modifications and transcription factors can be tested on various cell types of interest to further our understanding of cis-regulatory elements.

Een semiautomatiseerde ChIP-Seq-procedure voor grootschalige epigenetische studies

Abstract