Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Resumo

Fluorescência de RNA de molécula única in situ hibridização (smFISH) é um método para quantificar com precisão os níveis e a localização de RNAs específicos no nível único celular. Aqui, relatamos nossos protocolos de laboratório validados para processamento de banco molhado, imagem e análise de imagens para quantificação de células únicas de RNAs específicas.

Resumo

A transcrição genética é um processo essencial na biologia celular, e permite que as células interpretem e respondam a pistas internas e externas. Os métodos tradicionais de população em massa (Northern blot, PCR e RNAseq) que medem os níveis de mRNA não têm a capacidade de fornecer informações sobre a variação célula-celular nas respostas. A visualização e quantificação de células únicas precisas e allelic é possível através de fluorescência de RNA de molécula única na hibridização situ (smFISH). O RNA-FISH é realizado por RNAs de alvo hibridizado com sondas oligonucleotídeas rotuladas. Estes podem ser imagens em modalidades de rendimento médio/alto e, por meio de pipelines de análise de imagem, fornecem dados quantitativos tanto sobre RNAs maduras quanto nascentes, todos no nível único celular. A fixação, permeabilização, hibridização e medidas de imagem foram otimizadas em laboratório ao longo de muitos anos usando o sistema de modelo descrito aqui, o que resulta em uma análise celular única bem sucedida e robusta da rotulagem smFISH. O principal objetivo com a preparação e processamento da amostra é produzir imagens de alta qualidade caracterizadas por uma alta relação sinal-ruído para reduzir falsos positivos e fornecer dados mais precisos. Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo o pipeline desde a preparação da amostra até a análise de dados em conjunto com sugestões e etapas de otimização para adaptar a amostras específicas.

Introdução

Transcrição genética e tradução são os dois principais processos envolvidos no dogma central da biologia, indo da sequência de DNA para RNA para proteína¹. Neste estudo, focamos na produção de RNA mensageiro (mRNA) durante a transcrição. A molécula nascente de RNA inclui introns não codificadores e exons de codificação. Os introns são co-transcriçãoseticamente emendados antes que o mRNA se mova para o citoplasma para tradução nos ribossomos^2,3.

Tradicionalmente, a medição do mRNA é realizada em populações a granel de células (centenas a milhões) com ensaios c....

Protocolo

Para garantir os melhores resultados, a parte de laboratório molhada deste protocolo requer precauções padrão sem RNase em todas as etapas. Por exemplo, o uso de pontas de pipeta filtradas, vasos estéreis e tampões sem RNase é altamente incentivado. O uso de inibidores de RNase, como os complexos ribonucleosídeos vanadyl, também é sugerido, especialmente para RNAs de alvo de baixa abundância.

1. Cultura celular e configuração experimental

1. Manter as células cancerígenas de mama mcf-7 aderentes (ATCC #HTB-22) em um frasco de cultura tecidual T75 com fenol-vermelho livre (apenas necessário para experimentos de estimu....

Resultados

Para analisar as respostas hormonais via smFISH, como exemplo, optou-se pelo modelo receptor de estrogênio (ER) utilizado em ensaios de alto rendimento para determinar a presença de produtos químicos endócrinos em desastres ambientais no contexto de participação no Programa de Pesquisa de Superfundo^{niehs 7}. Neste experimento, as células cancerígenas de mama mcf-7 aderiram foram tratadas com o agonista ER 17β-estradiol (E2, 10 nM) ou veículo (DMSO) durante 24 horas. Conjuntos de sondas se.......

Discussão

A metodologia smFISH descrita baseia-se nos protocolos publicados anteriormente^7,12,14. Neste protocolo, explicamos as etapas críticas que foram otimizadas desde o laboratório molhado (incluindo densidade de semeadura, tempo de fixação, permeabilização e concentração de sondas), até análise de imagens e imagens, fornecendo um pipeline experimental completo para laboratórios interessados em realizar análises celulares.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2257	CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free	ThermoFisher Scientific	AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose	Fisher Scientific	MT10017CV	Manufactured by Invitrogen
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile	Sigma-Aldrich	3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++	Corning	21030CV	Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%)	Fisher Scientific	07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Corning	353047	Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL	Fisher Scientific	50-753-2978	Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope	GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade	Fisher Scientific	SH3053802
Immersion Oil 1.516	GE Healthcare Life Sciences	29162940	Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution	Fisher Scientific	MT25005Cl	Manufactured by Corning
MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
Molecular Grade Formamide	Promega	PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective	Olympus
Parafilm	Bemis Company, Inc.	52858-076	Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicilin-Streptomycin Solution	Fisher Scientific	MT3001Cl	Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex	VWR	101229-716	Manufactured by New England Biosciences
RNase Away	Ambion	9780
Sodium pyruvate, 100 mM	Fisher Scientific	11-360-070	Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5	Fisher Scientific	12-545-81P
Triton X-100, 100 mL	Fisher Scientific	BP151-100	Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25%	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL	Fisher Scientific	NC9265087	Manufactured by Vector Laboratories