Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie bietet effiziente Lösungen, um komplexe Prozesse auf mehreren biologisch relevanten Skalen zu untersuchen. Probenkammer-basierte Setups, die speziell entwickelt wurden, um die dreidimensionale Integrität der Probe zu erhalten und in der Regel Probenrotation aufweisen, sind die beste Wahl in der Entwicklungsbiologie. Zum Beispiel wurden sie verwendet, um die gesamte embryonale Morphogenese der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und des Rotmehlkäfers Tribolium castaneumzu dokumentieren. Viele verfügbare Live-Bildgebungsprotokolle bieten jedoch nur experimentelle Frameworks für einzelne Embryonen. Gerade bei Vergleichsstudien sind solche Ansätze unbequem, da sequenzielle abgebildete Proben von der Umgebungsvarianz beeinflusst werden. Darüber hinaus begrenzt dies die Anzahl der Proben, die innerhalb einer bestimmten Zeit untersucht werden können. Wir bieten einen experimentellen Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung, der den Durchsatz in Probenkammer-basierten Setups erhöht und somit ähnliche Umgebungsbedingungen für alle Proben gewährleistet. Zunächst bieten wir eine Kalibrierrichtlinie für Lichtbogenfluoreszenzmikroskope an. Zweitens schlagen wir eine Montagemethode für mehrere Embryonen vor, die mit der Probenrotation kompatibel ist. Drittens bieten wir beispielhafte dreidimensionale Live-Imaging-Datensätze von Drosophila, für die wir drei transgene Linien mit fluoreszierend markierten Kernen sowie von Triboliumgegenüberstellen, für die wir die Leistung von drei transgenen Sublinien vergleichen, die dasselbe Transgen tragen, aber an verschiedenen genomischen Stellen. Unser Protokoll wurde speziell für vergleichende Studien entwickelt, da es proaktiv die Umgebungsvarianz anspricht, die immer in der sequenziellen Live-Bildgebung vorhanden ist. Dies ist besonders wichtig für quantitative Analysen und Die Charakterisierung von aberrationalen Phänotypen, die z.B. aus Knockout-Experimenten resultieren. Darüber hinaus erhöht es den Gesamtdurchsatz, was sehr praktisch ist, wenn der Zugang zu Lichtblattfluoreszenzmikroskopen begrenzt ist. Schließlich kann die vorgeschlagene Montagemethode für andere Insektenarten und weitere Modellorganismen, z.B. Zebrafische, ohne Optimierungsaufwand angepasst werden.