פרופיל תאי בתפוקה גבוהה של תרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים באמצעות קווי תאי HiBiT CRISPR

תרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים, כולל דבקים מולקולריים או פרוטאוליזה המכוונת נגד כימרות, הן שיטה טיפולית חדשה ומלהיבה בגילוי תרופות של מולקולות קטנות. סוג זה של תרכובות גורם לפירוק חלבונים על ידי קירוב לחלבון המטרה ולחלבוני המנגנון E3 ליגאז הדרושים ליוביקוויטינאט ובסופו של דבר לפירוק חלבון המטרה דרך מסלול יוביקוויטין-פרוטאזומלי (UPP). עם זאת, יצירת פרופיל של פירוק חלבון מטרה באופן בעל תפוקה גבוהה נותרה מאתגרת ביותר בהתחשב במורכבות המסלולים התאיים הנדרשים להשגת פירוק. כאן אנו מציגים פרוטוקול ואסטרטגיית סינון המבוססים על שימוש בתיוג אנדוגני CRISPR/Cas9 של חלבוני מטרה עם תג 11 חומצות אמינו HiBiT אשר משלים עם זיקה גבוהה לחלבון LgBiT, כדי לייצר חלבון זוהר. ניתן להשתמש בקווי תאים ממוקדי קריספר אלה עם תגים אנדוגניים כדי למדוד השפלה המושרה על ידי תרכובות במצבים חיים קינטיים בזמן אמת או במצבי ליטית של נקודת קצה על ידי ניטור אות זוהר באמצעות קורא מבוסס צלחת זוהרת. כאן אנו מתארים את פרוטוקולי הסינון המומלצים עבור הפורמטים השונים, וגם מתארים את חישוב פרמטרי ההשפלה העיקריים של קצב, Dmax, DC 50, Dmax₅₀, כמו גם ריבוב עם מבחני כדאיות התא. גישות אלה מאפשרות גילוי וטריאז'ינג מהירים של תרכובות בשלבים מוקדמים תוך שמירה על ביטוי אנדוגני וויסות של חלבוני מטרה ברקע תאי רלוונטי, ומאפשרות אופטימיזציה יעילה של תרכובות טיפוליות עופרת.