Spotvariation Fluorescenskorrelationsspektroskopi för analys av molekylär diffusion vid plasmamembranet i levande celler

Dynamiska biologiska processer i levande celler, inklusive de som är associerade med plasmamembranorganisation, förekommer på olika rumsliga och tidsmässiga skalor, allt från nanometer till mikrometer respektive mikrosekunder till minuter. Ett så brett spektrum av biologiska processer utmanar konventionella mikroskopimetoder. Här beskriver vi proceduren för att implementera spotvariation Fluorescenskorrelationsspektroskopi (svFCS) mätningar med hjälp av ett klassiskt fluorescensmikroskop som har anpassats. Protokollet innehåller en specifik prestandakontroll av svFCS-installationen och riktlinjerna för molekylära diffusionsmätningar av svFCS på plasmamembranet i levande celler under fysiologiska förhållanden. Dessutom tillhandahåller vi ett förfarande för att störa plasmamembranflottanodomäner genom kolesteroloxidasbehandling och visar hur dessa förändringar i plasmamembranets laterala organisation kan avslöjas genom svFCS-analys. Sammanfattningsvis kan denna fluorescensbaserade metod ge oöverträffade detaljer om plasmamembranets laterala organisation med lämplig rumslig och tidsmässig upplösning.