Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse National Institute of Health (GM097569).

1. Snel protocol om de α- en β-subeenheid en de opnieuw verbonden α2β2StTS complex te zuiveren
<ol><li>DNA-subcloning in pETSUMO-expressievector<ol><li>Verkrijg het translationeel koppelingsgen (trpA en trpB) dat codeert voor de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase van de bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium gekloond in de pEBA-10 expressievector22. Gebruik pEBA-10 vector als DNA-sjabloon. OPMERKIN...

<ol>
	<li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel.">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li><li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+mine+for+enzymologists.">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li><li>Dunn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+substrate+channeling+and+catalysis+in+the+tryptophan+synthase+bienzyme+complex.">Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).</li><li>Chaudhary, K., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protozoan+genomics+for+drug+discovery.">Protozoan genomics for drug discovery.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).</li><li>Caldwell, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+in+Chlamydia+trachomatis+tryptophan+synthase+genes+differentiate+between+genital+and+ocular+isolates.">Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).</li><li>Kulik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+structural+basis+of+the+catalytic+mechanism+and+the+regulation+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium+and+BX1+from+maize,+two+evolutionarily+related+enzymes.">On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).</li><li>Barends, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanistic+implications+of+a+tryptophan+synthase+quinonoid+intermediate.">Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate.</a> Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).</li><li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase,+a+two-component+enzyme.">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li><li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A+protein+of+the+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+Purification,+crystallization,+and+composition+studies.">The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).</li><li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase.">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li><li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield.">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li><li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex.">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li><li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments.">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li><li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li><li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86,+lysine+87,+arginine+148,+cysteine+170,+and+cysteine+230.">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li><li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+K++or+Cs++for+Na++induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex.">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+mutant+(betaK87T)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes.">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li><li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase.">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li><li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crystallography+of+a+true+substrate,+indole-3-glycerol+phosphate,+bound+to+a+mutant+(alphaD60N)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49.">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li><li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate.">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li><li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase.">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li><li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium:+On+the+roles+of+beta+(2)+subunit+Lys-382.">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Lowry, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Measurement+with+the+Folin+Phenol+Reagent.">Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.</a> Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mutagenesis+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium.+Changing+arginine+179+to+leucine+alters+the+reciprocal+transmission+of+substrate-induced+conformational+changes+between+the+alpha+and+beta+2+subunits.">Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).</li><li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iMOSFLM:+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM.">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, 271-281 (2011).</li><li>Evans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+and+Assessment+of+Data+Quality.">Scaling and Assessment of Data Quality.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 72-82 (2006).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+replacement+with+MOLREP.">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 213-221 (2010).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 486-501 (2010).</li><li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method.">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, 240-255 (1997).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, 352-367 (2012).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+content+of+protein+crystals.">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li><li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coefficient+probabilities:+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins,+DNA,+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals.">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li></ol>

We hebben met succes mutante vorm α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, en α2β2 βS377A StTS complexen voor structuur-functie correlatie studies. Aanvankelijk hebben we geprobeerd de mutanten te zuiveren met behulp van een eerder zuiveringsprotocol22, dat α2β2StTS-complex kristallisatie met PEG 8000 en spermine vereist tijdens zuivering. Hoewel de kristallisatiesnelheid afhangt van de mutante vo...

Het tryptofaan synthase (TS) bi-enzym complex (α2β2) is een allosterisch enzym, dat de laatste twee stappen in de biosynthese van het aminozuur L-tryptofaan in bacteriën, planten en schimmels1,2,3katalyseert. Bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) veroorzaakt een ernstige gastro-intestinale infectie bij mens en andere dieren. Aangezien mensen en hogere dieren geen TS hebben (EC 4.2.1.20), is deremmingvan S. typhimurium α 2 β2 TS-complex (α2β2StTS) onderzocht als een potentieel geneesmiddeldoel voor de behandeling van cryptosporidiose en tuberculose4, genitale en oculaire infecties5, en voor potentieel herbicidegebruik in de landbouw6. De α-subeenheid katalyseert het aldolytische decolleté van indool-3-glycerolfosfaat (IGP) tot glyceraldehyde-3-fosfaat (GAP) en indool, door de vorming van een indolytine tautomeer intermediair en vervolgens koolstof-koolstofbindingssplitsing om GAP en indool3,6te produceren . De β-katalytische plaats bevat een pyridoxaal 5′-fosfaat (PLP) cofactormolecuul gebonden aan β-Lys87 via een Schiff-basis, dat functioneert als een elektronenzinking in de loop van de reacties op het enzym β-subeenheid3,7. De β-site katalyseert de vervanging van de L-Serine side-chain hydroxyl door indool om L-tryptofaan en een watermolecuul in een PLP-afhankelijke reactie te geven. Sint TS dient als een reeds lang bestaand model voor het onderzoek naar substraatangeulering en allosterische communicatie binnen multi-enzymcomplexen2,3. Bidirectionele allosterische communicatie tussen de α- en β-subeenheden van TS is noodzakelijk om de katalytische stappen te synchroniseren en indoolafgifte tijdens L-tryptofaansynthese te voorkomen3. Om deze inspanning uit te breiden, hebben we verschillende mutanten (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr en β-Ser377Ala) voorbereid door eenpuntsmutatie om te worden gebruikt bij verdere verkenningen van de relatie tussen enzymstructuur, mechanisme en functie op de katalytische locatie van de StTS β-subeenheid.
Gedetailleerd onderzoek naar het katalytische mechanisme van α2β2StTS is geïnitieerd door de onderzoeksgroep van Edith W. Miles. Vroege studies met inheemse Escherichia coli α2β2 TS-complex hebben zich gericht op de zuivering en karakterisering van het geïsoleerde α-subeenheid8,9, geïsoleerde β-subeenheid10,11 en de reconstitutie van het α2β2 TS-complex van de geïsoleerde subeenheden12. De zuivering werd uitgevoerd door ammoniumsulfaatprecipitatie, monsterdialyse, DEAE-Sephadexchromatografie, dialyse en een tweede chromatografische ronde op een DEAE-Sephadex kolom12. In een ander protocol werd de zuivering van hetzelfde complex verbeterd door het geklaarde cellysaat op een DEAE-Sephadex-kolom te laden, gevolgd door een chromatografische stap op een Sepharose 4B-kolom, ammoniumsulfaatprecipitatie en dialyse13. Beide zuiveringsprotocollen duren 4-5 dagen. Escherichia coli α2β2 TS complex gekristalliseerd, maar kristallen waren op dat moment niet geschikt voor röntgendiffractie.
In een nieuwe studie werden recombinante en wilde typevormen van S. typhimurium α2β2 TS-complex gezuiverd en gekristalliseerd14,15. Het recombinant α2β2StTS complex werd overexpressie in E. coli stam CB149 met de pEBA-10 expressievector. Initiële kristallisatie en röntgendiffractiegegevensverzameling en analyse van de α2β2StTS-complex werden gerapporteerd14. Lange en dunne naalden zoals α2β2StTS-kristallen hebben echter de structurele studies aangetast. In een poging om betere röntgendiffractiegegevens te verzamelen, werd een ander zuiveringsprotocol beschreven om het wilde type en de mutante vormen van de α2β2StTS-complex15te zuiveren. Zuivering werd uitgevoerd met een eerste neerslag met spermine en PEG 8.000 in het geklaarde cellysaat en een groot omvangrijk neerslag werd verwijderd door centrifugeren. De supernatansfractie met grote hoeveelheden α2β2StTS-complex werd 16-48 uur bij 4 °C bewaard totdat gele kristallen neersloegen. Kristallen werden gewassen en uitgebreid gedialyseerd tegen verschillende buffers. Eiwitcomplex werd opnieuw gekeerd in buffer met ammoniumsulfaat en gedialyseerd15. Hoewel eiwitkristallisatie afhankelijk is van eiwit- en precipitante concentraties in oplossing, is het moeilijk om zuivering te controleren, te voorspellen en te reproduceren voor andere mutante vormen van α2β2StTS-complex in oplossing. Dit protocol heeft als voordeel dat het geen chromatografische methoden gebruikt; de nadelen zijn echter de lange zuiveringstijd die nodig is om te kristalliseren, dialyseren en recrystalliseren, meestal 5-7 dagen. Om kristallen te verkrijgen die geschikt zijn voor het verzamelen van röntgengegevens, werden meer dan 600 kristallisatieomstandigheden geëvalueerd met behulp van een combinatie en variatie van eiwitconcentratie, temperatuur, precipitanten (PEG 4.000, 6.000 en 8.000) en additieven (CaCl2,MnCl2,ZnCl2,cadaverine, putrescine, spermine of spermidine)15. Kristallen hadden een betere kristallijne vorm en groeiden sneller in omstandigheden met 12% PEG 8.000 en 2 mM spermine. Kristallisatie was gunstiger bij 25 °C in plaats van bij 4, 30 of 42 °C en groeide binnen 3 dagen15uit tot maximale afmetingen. Verschillende α2β2StTS kristalstructuren werden gemeld op dat moment (1996-1999)16,17,18,19,20,21 en vele andere structuren zijn tot op heden gepubliceerd.
Hier is het belangrijkste doel om alternatieve protocollen te presenteren om tryptofaansynthase te zuiveren en eiwitkristallisatie te optimaliseren. Het huidige werk toont significante verbeteringen om het wilde type geïsoleerde α-subeenheid (αStTS), geïsoleerde β-subeenheid (βStTS) te zuiveren, gereconstitueerd α2β2StTS-complex van de geïsoleerde subeenheden, en wilde type en mutante vormen van de α2β2StTS complex. De voordelen ten opzichte van eerdere protocollen zijn aanzienlijk omdat de zuiveringstijd aanzienlijk werd verkort en kristallisatie en cryoprotectie werden geoptimaliseerd. Mutante vormen van α2β2StTS complex ontworpen in dit werk hebben gekristalliseerd in de buurt van dezelfde voorwaarde gebruikt voor de wild type vorm. Echter, fijne kristallisatie optimalisatie was nodig om grote enkele kristallen van voldoende kwaliteit te verkrijgen voor structuurbepaling bij bijna atoomresolutie. Tot op heden zijn er 134 tryptofaan synthase kristalstructuren afgezet in de Protein Data Bank (PDB), respectievelijk 101, 31 en 2 kristalstructuren voor bacteriën, archaea en eukaryote. Mooi, 73 structuren behoren tot S. enterica serovar typhimurium en 5 kristalstructuren van de α2β2StTS complex hebben resolutielimieten hoger dan 1,50 Angstroms. Het is niet verwonderlijk dat 4 van de 5 werden voorbereid in onze onderzoeksgroep (PDB ID's: 5CGQ om 1,18 Å, 4HT3 om 1,30 Å, 4HPJ om 1,45 Å, 6DZ4 om 1,45 Å-resolutie). De verfijnde kristalstructuren van mutante vorm van α2β2StTS complex zullen naar verwachting nieuwe inzichten verschaffen in het mechanisme en de rollen die worden gespeeld door essentiële aminozuurresiduen die betrokken zijn bij de L-tryptofaansynthese.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL 10 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL 100 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430489</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-141</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td>24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td>centrifuge conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB15 ACCUMET Basic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>Agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S35836</td>
			<td>incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2646100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier</td>
			<td>Brason</td>
			<td>B450</td>
			<td>Cell disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP210-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC213601000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>HF polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-297-018</td>
			<td>dNTPs set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42">Excella E25R Orbital Shaker</td>
			<td>Eppendorf New Brunswick</td>
			<td>M1353-0004</td>
			<td>Orbital incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0004</td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210012</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-5255-01</td>
			<td>5 mL Histrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelvinator Series-100</td>
			<td>Kelvinator</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Ultra low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Liquid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Solid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0193S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA affinity beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R90115</td>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-865-0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxal phosphate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC228170010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-200 HR</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-000-196</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-5B centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1004</td>
			<td>Floor cetrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC132750010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-002-491</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>DNA liagse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubl-specific protease 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12588018</td>
			<td>SUMO Protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase

Structurele studies met tryptofaan synthase (TS) bi-enzym complex (α2β2 TS) van Salmonella typhimurium zijn uitgevoerd om het katalytische mechanisme, allosterisch gedrag en details van de enzymatische transformatie van substraat naar product in PLP-afhankelijke enzymen beter te begrijpen. In dit werk maakte een nieuw expressiesysteem om de geïsoleerde α- en geïsoleerde β-subeenheid te produceren, de zuivering van grote hoeveelheden zuivere subeenheden en α2β2StTS-complex van de geïsoleerde subeenheden binnen 2 dagen mogelijk. De zuivering werd uitgevoerd door affiniteitschromatografie gevolgd door decolleté van de affiniteitstag, ammoniumsulfaatprecipitatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Om de rol van belangrijke residuen in het enzym β-site beter te begrijpen, werd site-directe mutagenese uitgevoerd in eerdere structurele studies. Een ander protocol werd gemaakt om het wilde type en mutant te zuiveren α2β2StTS complexen. Een eenvoudig, snel en efficiënt protocol met ammoniumsulfaatfractie en SEC maakte zuivering van α2β2StTS-complex in één dag mogelijk. Beide zuiveringsprotocollen die in dit werk worden beschreven, hebben aanzienlijke voordelen in vergelijking met eerdere protocollen om hetzelfde complex te zuiveren met BEHULP van PEG 8000 en spermine om de α2β2StTS-complex langs het zuiveringsprotocol te kristalliseren. Kristallisatie van het wilde type en sommige mutante vormen vindt plaats onder iets andere omstandigheden, waardoor de zuivering van sommige mutanten met PEG 8000 en spermine wordt aangetast. Om kristallen voor te bereiden die geschikt zijn voor röntgenkristallografische studies werden verschillende inspanningen geleverd om kristallisatie, kristalkwaliteit en cryoprotectie teoptimaliseren. De hier gepresenteerde methoden moeten algemeen toepasbaar zijn voor de zuivering van tryptofaansynthasesubeenheden en wilde α2β2StTS-complexen.

Zuivering van de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase De α-subeenheid (αStTS) en de β-subeenheid (βStTS) van het Salmonella typhimurium tryptofaan synthase werden gesubclod in de gemodificeerde pET SUMO vector. Figuur 1A toont representatieve SDS-PAGE resultaten van twee sterke banden die overeenkomen met de His6-SUMO-αStTS (...

Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Dit artikel presenteert een reeks opeenvolgende methoden voor de expressie en zuivering van Salmonella typhimurium tryptofaan synthase comp dit protocol een snel systeem om het eiwitcomplex in een dag te zuiveren. Behandelde methoden zijn site-gerichte mutagenese, eiwitexpressie in Escherichia coli,affiniteitschromatografie, gelfiltratiechromatografie en kristallisatie.

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

This protocol to purify the enzyme tryptophan synthase from Salmonella typhimurium is fast, simple, and short. Ammonia sulfate fractionation and size exclusion chromatography make it possible to purify the wild type and mutant tryptophan synthase complex in a single day. This technique can be applied to purify other related proteins since ammonia sulfate fractionation and size exclusion chromatography are commonly used to purify non-tagged proteins.To begin, disrupt the cell pellet by sonication on an ice water bath at 80%amplitude for 20 cycles using 10-second pulses and 20-second rests. Centrifuge the cell lysate at 30, 000 times g for 30 minutes at 25 degrees Celsius, and aspirate the supernatant without dislodging the pellet. Filter the clarified supernatant fraction with a 0.45-micrometer filter at room temperature.Slowly add small amounts of ammonium sulfate to the filtrate until 20%saturation is reached. Carry out ammonium sulfate fractionation at 25 degrees Celsius, and gently stir the solution for 10 minutes, taking care to avoid bubbles. Centrifuge the solution again for 10 minutes, and transfer the supernatant into a clean flask for further use.Gently resuspend the pellet in 20 milliliters of sample buffer, and prepare a sample to run SDS-PAGE. Add ammonium sulfate to the supernatant until 30%saturation is reached, and stir the solution, avoiding bubbles. Centrifuge the solution again for 10 minutes, and transfer the supernatant to a clean flask for further use.Gently resuspend the obtained 40%pellet fraction in 10 milliliters of sample buffer two, and prepare a sample to run SDS-PAGE. Then microcentrifuge the 40%protein sample at 10, 000 times g for 20 minutes at four degrees Celsius, and load the obtained supernatant on a previously equilibrated HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR column attached to a fast protein liquid chromatography instrument at a flow rate of 0.5 milliliters per minute. Assess the collected peak fractions and the ammonium sulfate fractions on a 12%SDS-PAGE gel stained with Coomassie brilliant blue.Concentrate the wild type or mutant alpha-two beta-two Salmonella typhimurium tryptophan synthase complex with a 100-kilodalton centrifugal filter by spinning at 3, 000 times g, at four degrees Celsius. Transfer the concentrated protein to a fresh two-milliliter tube, and again centrifuge at 10, 000 times g for 10 minutes at four degrees to remove aggregates. After determining the protein concentration of the sample, prepare 0.5 milliliter aliquots at 20 to 25 milligrams per milliliter.Flash freeze them in liquid nitrogen, and store them at minus 80 degrees. Prepare a five-milliliter stock solution of 200-millimolar spermine in water, and store it in 500 microliter aliquots at minus 20 degrees. Then prepare a 50-milliliter stock solution of 30%polyethylene glycol 8, 000 in water, and keep 25 milliliters in a 50-milliliter disposable centrifuge conical flask at 25 degrees Celsius.Prepare 25-milliliter stock solutions of one-molar cesium chloride and sodium chloride, each in water, and keep them at 25 degrees Celsius. Prepare three sets of 50-milliliter stock solutions of one-molar bicine, and titrate it with cesium hydroxide or sodium hydroxide to obtain buffered solutions at pH 7.6, 7.8, and eight. Keep 25-milliliter aliquots of the solutions at four degrees Celsius.Thaw a sample of alpha-two beta-two Salmonella typhimurium tryptophan synthase complex in an ice bath. Then microcentrifuge it at 10, 000 times g for 10 minutes at 25 degrees Celsius. Transfer the clear supernatant fraction into a clean centrifuge tube.Estimate the protein concentration of the supernatant, and dilute the aliquots to 15 milligrams per milliliter with 50-millimolar bicine cesium hydroxide or bicine sodium hydroxide of pH 7.8, containing 50-millimolar cesium or sodium chloride. Prepare 500 microliters of reservoir solutions for three 24-well sitting drop plates in sterile 1.5-milliliter microcentrifuge tubes. Vary the concentration of PEG 8, 000 and spermine, and change buffer pH as described in the text manuscript for each set.Cap the tubes, and vigorously vortex for 10 seconds, before centrifuging them at 10, 000 times g for 10 minutes at 25 degrees Celsius to remove air bubbles. Dispense 500 microliters of this solution in each reservoir. Dispense five microliters of protein solution at 15 micrograms per liter into each sitting drop well using a P-10 micropipette.Then add five microliters of each corresponding reservoir solution to the protein drop. Avoid air bubbles during mixing, and do not pipette up and down. Finally, cover the plate with transparent adhesive tape, and store it at 25 degrees.The crystals appear in two to five days and grow to their full dimensions within two weeks. This protocol was used to subclone the alpha subunit and the beta subunit of the Salmonella typhimurium tryptophan synthase into the modified pET SUMO vector. Representative SDS-PAGE results of two strong bands corresponding to the His6-SUMO-alpha and His6-SUMO-beta tryptophan synthase fusion protein are shown here.Each protein was purified by nickel-nitrilotriacetic acid affinity chromatography and ammonium sulfate precipitation, followed by His-SUMO-tag cleavage, removal of His-SUMO-tag traces, and protein concentration measurement. The elution profile of the alpha subunit, beta subunit, and alpha-two beta-two Salmonella typhimurium tryptophan synthase complex on SEC, and the purity of their peak fractions are shown here. After generating mutant forms of the tryptophan synthase complex, ammonium sulfate fractionation was used to remove the contaminant proteins from the heterologous expression system.A representative elution profile with a relative elution position of the alpha-two beta-two Salmonella typhimurium tryptophan synthase complex on an exclusion chromatography column is shown here. The purity of the excluded peak fractions was analyzed using SDS-PAGE before pooling. Large single crystals were obtained through a fine crystallization optimization by varying PEG 8, 000 and spermine concentrations and bicine buffer pH.Crystals with different morphologies appeared in two to five days and grew to full size within two weeks. The validation of electron density maps for the crystal structure of the wild type alpha-two beta-two Salmonella typhimurium tryptophan synthase complex was elucidated after crystal structure refinement. When performing this protocol, complete the initial purification steps at room temperature as soon as possible to prevent tryptophan synthase activity loss.The crystal structures of the mutants are anticipated to provide new insights into the mechanism and roles played by key residues in L-tryptophan synthesis.

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Abstract