刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いた カエノラム型エレガンス における脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング

要約

刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡検査は、特定の化学部分の選択的でラベルフリーなイメージングを可能にし、生体内の脂質分子を画像化するために効果的に採用されています。ここでは、SRS顕微鏡の原理を簡単に紹介し、 カエノハブディティス・エレガンスにおける脂質貯蔵のイメージングにおけるその使用法について説明する。

要約

脂質代謝は、細胞や生物の健康に必要な基本的な生理学的プロセスです。脂質代謝の調節不調整は、しばしば肥満を引き起こすと心血管障害を含む多くの関連疾患, II型糖尿病, 癌.脂質代謝調節の現在の理解を進めるために、時間と空間で生体内脂質貯蔵レベルを正確に測定する定量的方法がますます重要かつ有用になってきています。脂質蓄積を分析する従来のアプローチは、微視的な評価のために半定量的であるか、生化学的測定のための時空間的な情報を欠いている。刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡は、細胞内分解能を持つ細胞内の脂質を迅速かつ定量的に検出できる、ラベルフリーの化学イメージング技術です。このコントラストは固有の分子振動から利用され、SRS顕微鏡検査は生きている動物の脂質の4次元追跡も可能にする。過去10年間、SRS顕微鏡は、生物医学研究における低分子イメージングに広く使用され、従来の蛍光染色法および脂質抽出法の大きな限界を克服してきました。研究室では、強力なモデル生物 であるカエノハブディティス・エレガンス が利用できる遺伝的および生化学的ツールとSRS顕微鏡を組み合わせて、異なる細胞および組織にわたる脂質滴の分布と不均一性を調べ、最終的には脂質代謝を調節する新しい保存シグナル伝達経路を発見しました。ここでは、SRS顕微鏡の働く原理と詳細な設定を提示し、野生型およびインスリンシグナル伝達欠損変異体 C.エレガンスの異なる発達時点における脂質貯蔵の定量に使用する方法を提供する。

概要

肥満は世界中の人口の3分の1を脅かす世界的な健康問題となっており、貧しい精神的健康¹ と糖尿病^2、心血管疾患³ およびいくつかのタイプの癌^を含む致命的な疾患との関連を考えると、深刻な医学的懸念を提示する。肥満の背後にある生物学的問題をよりよく理解するためには脂質代謝の研究が不可欠です。脂質の迅速かつ特異的な定量化は、脂肪酸およびその誘導体、ならびにステロール含有代謝産物の検出を伴い、高感度で、好ましくは空間情報を有する。脂質は、本来の蛍光性を欠き、蛍光タグ付けが容易にできないため、画像に挑戦的なターゲットです。蛍光タグは、多くの場合、脂質分子よりも大きく、したがって、生体内の適用のために化学的に侵襲的で実用的でなくなることができます。脂質分子⁵の疎水構造を維持するためには、ラベルフリーまたは最小限の標識戦略が必要である。近年のイメージング技術の発展は、生細胞、組織、生物における脂質の標識のないイメージングの機会を生み出しています。

生体試料における脂質保存分析の従来のアプローチには、生化学的アッセイや脂溶性染料による染色プロトコルが含まれます。質量分析(MS)を含む生化学的定量アッセイは、その分子の解決性において比類のないものですが、非常に....

プロトコル

1. 刺激されたラマン散乱顕微鏡のためのインストゥルメンタルセットアップ

注:SRS顕微鏡システムは、ポンプ内蔵光学パラメトリック発振器と共焦点レーザー走査顕微鏡を備えたピコ秒レーザー上に構築されています。発振器は1,064 nmのストークスビームおよび700-990 nmの間のポンプビームの調整を含む2つのピコ秒の脈拍列車を提供する。2つのビームの時間的および空間的な重なりはレーザーの内部で達成される。内蔵の電気光学変調器(EOM)は、SRS顕微鏡用に特別に設計されています。このプロトコルは、レーザーと顕微鏡の結合、およびこのシステムの日常操作に焦点を当てます(図1)。SRS顕微鏡システムの構成は、過去10年間で進化しています。なお、以下の説明は、いくつかの構成のうちの1つを表すのみである。

1. レーザービームを顕微鏡に送り込む
   1. ピコ秒光源出口から、顕微鏡のスキャナーのIRレーザー入力ポートまでビームを持ち上げるペリスコープを設置します。
      注意:操作前にレーザーシステムマニュアルを読み、このクラスIVレーザーシステムによって生成された近赤外線は、目や皮膚に深刻な害を引き起こす可能性があるため、すべての必要な予防措置を取ります。施設環境安全部門に必要な研修を完了します。カフスリーブの保護ゴーグルとラボコートを着用してください。
   2. まず、ポンプビームを750nm....

結果

インスリンシグナル伝達は、発達、生殖、寿命、代謝に影響を与える重要な内分泌経路である。ワームにおいて、インスリンシグナル伝達は、約40種類のインスリン様ペプチドリガンド、インスリン様成長因子受容体オルソログDAF-2、下流PI3K/AKTキナーゼカスケード、及びFoxO転写因子オルソログ、DAF-16²⁰からなる。daf-2変異体は、インスリン受容体を欠いている、それ?.......

ディスカッション

肥満およびそれに関連する代謝障害に対する防御において、脂質恒常性の調節機構をよりよく理解するための重要な研究努力が実施されている。生体試料中の脂質分子の定量的検出では、SRS顕微鏡による標識のないイメージングが、生化学的アッセイやその他の染色法に代わる信頼性の高い方法であることが証明されています。我々のグループ及び他の人々は、C.エレガンスとSRS顕微?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool - adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool - target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool - tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP