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この記事について

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要約

刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡検査は、特定の化学部分の選択的でラベルフリーなイメージングを可能にし、生体内の脂質分子を画像化するために効果的に採用されています。ここでは、SRS顕微鏡の原理を簡単に紹介し、 カエノハブディティス・エレガンスにおける脂質貯蔵のイメージングにおけるその使用法について説明する。

要約

脂質代謝は、細胞や生物の健康に必要な基本的な生理学的プロセスです。脂質代謝の調節不調整は、しばしば肥満を引き起こすと心血管障害を含む多くの関連疾患, II型糖尿病, 癌.脂質代謝調節の現在の理解を進めるために、時間と空間で生体内脂質貯蔵レベルを正確に測定する定量的方法がますます重要かつ有用になってきています。脂質蓄積を分析する従来のアプローチは、微視的な評価のために半定量的であるか、生化学的測定のための時空間的な情報を欠いている。刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡は、細胞内分解能を持つ細胞内の脂質を迅速かつ定量的に検出できる、ラベルフリーの化学イメージング技術です。このコントラストは固有の分子振動から利用され、SRS顕微鏡検査は生きている動物の脂質の4次元追跡も可能にする。過去10年間、SRS顕微鏡は、生物医学研究における低分子イメージングに広く使用され、従来の蛍光染色法および脂質抽出法の大きな限界を克服してきました。研究室では、強力なモデル生物 であるカエノハブディティス・エレガンス が利用できる遺伝的および生化学的ツールとSRS顕微鏡を組み合わせて、異なる細胞および組織にわたる脂質滴の分布と不均一性を調べ、最終的には脂質代謝を調節する新しい保存シグナル伝達経路を発見しました。ここでは、SRS顕微鏡の働く原理と詳細な設定を提示し、野生型およびインスリンシグナル伝達欠損変異体 C.エレガンスの異なる発達時点における脂質貯蔵の定量に使用する方法を提供する。

概要

肥満は世界中の人口の3分の1を脅かす世界的な健康問題となっており、貧しい精神的健康1 と糖尿病2、心血管疾患3 およびいくつかのタイプの癌を含む致命的な疾患との関連を考えると、深刻な医学的懸念を提示する。肥満の背後にある生物学的問題をよりよく理解するためには脂質代謝の研究が不可欠です。脂質の迅速かつ特異的な定量化は、脂肪酸およびその誘導体、ならびにステロール含有代謝産物の検出を伴い、高感度で、好ましくは空間情報を有する。脂質は、本来の蛍光性を欠き、蛍光タグ付けが容易にできないため、画像に挑戦的なターゲットです。蛍光タグは、多くの場合、脂質分子よりも大きく、したがって、生体内の適用のために化学的に侵襲的で実用的でなくなることができます。脂質分子5の疎水構造を維持するためには、ラベルフリーまたは最小限の標識戦略が必要である。近年のイメージング技術の発展は、生細胞、組織、生物における脂質の標識のないイメージングの機会を生み出しています。

生体試料における脂質保存分析の従来のアプローチには、生化学的アッセイや脂溶性染料による染色プロトコルが含まれます。質量分析(MS)を含む生化学的定量アッセイは、その分子の解決性において比類のないものですが、非常に大きなサンプル量を必要とし、サンプル調製には通常数時間かかり、生体システムのリアルタイムイメージングへの応用を制限します5。これらのアッセイのもう一つの大きな制限は、空間情報の欠如である。一方、オイルレッドOやスーダンブラックなどの親油性色素は、脂質貯蔵小器官の組織および細胞分布を提供し、MS技術と比較して、これらの染色法も低コストで、かつ実行しやすい。しかし、これらの染色プロトコルは固定を必要とし、脂質滴の疎水性に影響を与え、その構造に人工的な変化を生じ、実験6の間に矛盾を生じる。生化学的および染色技術に関連する技術的な困難は、脂質分子を画像化するためのラベルフリーの方法の探索と、脂質イメージングにおけるコヒーレントラマン散乱(CRS)顕微鏡の使用の急速な増加につながっている。

ラマン効果は、ラマンとクリシュナンによって最初に認識され、光子と相互作用すると、分子が波長の変化(レイリー散乱と呼ばれる)または変化した波長(ラマン散乱と呼ばれる)でめったに散乱光を生成することができ、この波長の変化は分子内の官能化学基の特徴であると報告した。分子内の化学結合がポンプ光子と呼ばれる入射光子によってより高い振動エネルギーレベルに励起されると、ストークス光子と呼ばれる散乱光子のエネルギーが低くなる。さもなければ、化学結合はもともとより高いレベルにあるならばより低い振動エネルギーレベルに達し、散乱された光子は反ストークス光子になるエネルギーを得る。インシデントと散乱フォトンの周波数差は、ラマンシフトと呼ばれます。分子内の各化学結合は、特徴的かつ定量的なラマンシフトを有する。例えば、CH2結合は、2,845cm-1のラマンシフトを有し、これは脂肪酸鎖8に豊富である。この自発的なラマン信号は一般的に非常に弱く、従来の自発的なラマン顕微鏡ではイメージング速度が大幅に制限されています。また、自発ラマン顕微鏡のイメージング速度と感度を高めるさまざまなアプローチが長年にわたって開発されてきました。コヒーレント・アンチ・ストークス・ラマン散乱(CARS)顕微鏡検査や刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡など、コヒーレントラマン散乱顕微鏡が最新の進歩である。CARSとSRSは、わずかに異なる動作原理を持っていますが、どちらもライブイメージング機能を備え、脂質貯蔵ダイナミクスに関する空間的および時間的な情報を生成することができ、小さなサンプルサイズしか必要としなくて済むラベルフリーの技術です。CARS顕微鏡は、様々な非線形プロセスに由来する非共振性バックグラウンドに苦しんでおり、CARS信号も分子濃度と非線形関係を有し、定量プロセス9を一緒に複雑にする。CARS顕微鏡とは異なり、SRS顕微鏡は非共振性のバックグラウンド信号を生成せず、対象分子の濃度に直線的に依存します。従って、現在SRS顕微鏡は、より広く脂質イメージングに使用されている。

SRS顕微鏡では、弱い自発的なラマン信号は、化学結合振動周波数と一致する周波数差を持つ2つの同期レーザービームによって励起されたときに増幅することができる。分子は、一貫した励起のために励起状態への遷移を増強する。その結果、ストークスフォトン生成の速度が上昇する。その結果、送信された「ストークス」ビームの強度が増加し(刺激されたラマンゲイン、SRG)、送信された「ポンプ」ビームの強度が減少する(刺激されたラマン損失、SRL)。SRGまたはSRL信号の検出は、特異的化学結合10を有する分子の刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡イメージングの基礎となる。2つのレーザービーム間の周波数差が目的の分子内の化学結合の振動周波数と一致しない場合、SRG信号もSRL信号も生成されません。SRS顕微鏡のイメージング速度は、ピクセルあたり約2μsecまたはフレームあたり1秒で、自発的なラマン顕微鏡11よりもはるかに高速です。SRS顕微鏡の典型的な横解像度は、回折限であり、約300nmである。さらに、SRS顕微鏡の2光子光学プロセスにより、相対厚組織サンプルの体積3Dイメージングが可能となり、イメージング深度は300〜500μmに達する可能性があります。全体として、SRS顕微鏡は、特定の生体分子、特に脂質を検出するための効率的でラベルフリーなイメージング技術を提示します。

脂質滴は、トリアシルグリセロール(TAG)およびコレステロールエステル(CE)を含む中性脂質の主な細胞貯蔵部位である単膜小器官である。これらの脂質分子の脂肪酸鎖中のCH2結合は、励起された2,845cm-1で強いSRSシグナルを生成し、インタクトな細胞、組織切片、さらには生物全体12、13、14、15の保存脂質レベルの検出および定量を可能にする。特に、C.エレガンスは、その透明性のために脂質イメージング研究に有用である。哺乳類と同様に、C.エレガンスも脂質滴に脂質を保存し、脂質分子の合成および分解経路は高度に保存されている16である。このプロトコルでは、SRS顕微鏡の原理を提供し、その基本的な設定を行い、C.エレガンスにおける脂質イメージングにおける使用法について説明します。

プロトコル

1. 刺激されたラマン散乱顕微鏡のためのインストゥルメンタルセットアップ

注:SRS顕微鏡システムは、ポンプ内蔵光学パラメトリック発振器と共焦点レーザー走査顕微鏡を備えたピコ秒レーザー上に構築されています。発振器は1,064 nmのストークスビームおよび700-990 nmの間のポンプビームの調整を含む2つのピコ秒の脈拍列車を提供する。2つのビームの時間的および空間的な重なりはレーザーの内部で達成される。内蔵の電気光学変調器(EOM)は、SRS顕微鏡用に特別に設計されています。このプロトコルは、レーザーと顕微鏡の結合、およびこのシステムの日常操作に焦点を当てます(図1)。SRS顕微鏡システムの構成は、過去10年間で進化しています。なお、以下の説明は、いくつかの構成のうちの1つを表すのみである。

  1. レーザービームを顕微鏡に送り込む
    1. ピコ秒光源出口から、顕微鏡のスキャナーのIRレーザー入力ポートまでビームを持ち上げるペリスコープを設置します。
      注意:操作前にレーザーシステムマニュアルを読み、このクラスIVレーザーシステムによって生成された近赤外線は、目や皮膚に深刻な害を引き起こす可能性があるため、すべての必要な予防措置を取ります。施設環境安全部門に必要な研修を完了します。カフスリーブの保護ゴーグルとラボコートを着用してください。
    2. まず、ポンプビームを750nmに設定し、レーザーパワーを50mWに下げ、視覚的に検査することができ、アライメントを関連付ける。次に、ビームエキスパンダー(図1、L1、L2)を使用して、顕微鏡目的の背面開口に合わせてビーム径を調整します。レーザー光線をペリスコープ(図1、P1、P2)に導くために、2つのリレーミラー(図1、M1、M2)を使用します。ペリスコープは、スキャナー開口部の高さまでビームを持ち上げ、アライメント用のステアリングミラーとしても機能します。
    3. チューニング範囲の中心にあるペリスコープのノブを設定し、レーザービームがミラーの中心に当たるような各ミラーの初期位置と角度を選択します。
    4. 目的砲塔の空のポートを使用して粗いアライメントを行い、パワーメータープローブを配置して透過光のパワーを測定します。顕微鏡のスキャナーを最高ズーム(50x)に設定し、その後、焦点を合わせるレーザービームスポットで透過光のパワーを測定します。各ミラー、M1とM2のノブを最適化し、最高の送信レーザーパワーを達成します。
    5. 位置合わせツールで細かい位置合わせを行います。空の目的の座席に蛍光ターゲットアライメントキャップを置き、スポットの中央にM1のノブを調整します。次に、ターゲット用の延長チューブを導入し、M2のノブを調整してスポットを中央に配置します。
    6. 梁がターゲットを両方の位置で中央揃えするまで、ステップ 1.1.4 と 1.1.5 を繰り返します。
  2. 検出と電子機器の接続
    1. SRS 検出モジュールをセットアップします。コンデンサーの後にビームスプリッターcuberを設置し、送信されたレーザーをフォトダイオードモジュールに向けます。モジュールは、フォトダイオードの活性領域に合わせてビームサイズを中継し、変更する望遠鏡と、変調されたストークスビームを除去し、ポンプビームを復調するために通過させる光学フィルターを備えています。
    2. 電子機器の接続を設定します(図1)。ストークスビームの強度はピコ秒の調整可能なレーザーの中の20 MHzの組み込みのEOMによって変調される。レーザからのモジュレーション周波数出力は、復調用の基準周波数としてロックインアンプに入力されます。フォトダイオードの出力信号をロックインアンプに送り込み、SRLを復調します。
      注:ワンボックスレーザーシステムはアップグレード可能で、製造日によって仕様が異なる場合があります。このプロトコルで使用されるピコ秒チューナブルレーザーシステムの以前のバージョンは、1,064 nmのストークスビームを持っていますが、最近のバージョンは1,031 nmのストークスビームを持っています。このプロトコルで使用されるEOMの変調周波数は8 MHzにカスタマイズされていますが、最近のシステムのデフォルトの変調周波数は10または20MHzになります。
    3. 最後に、ロックインアンプ出力をマイクロスコープのアナログボックスに送り込み、電気アナログ信号をデジタル信号に変換します。システムは SRS 信号を処理する準備ができているはずです。
  3. イメージング条件を最適化
    1. システムアライメント用の化学サンプルを作ります。例えば、ドデカンはC-H結合からの非常に強いSRS信号を有するので、顕微鏡を最適化するためにドデカンを使用する。ミニチャンバーを作るために安全なシールを使用してください。5 μLのドデカンを入れ、カバースリップで覆います。
      注: ドデカンサンプルが不明確に見えたり、破片が出たりしたら、2~3か月間のアライメントに使用できる新しいサンプルに交換してください。
    2. サンプルを顕微鏡のステージに置きます。液滴に適切に焦点を当てます。これは、ドデカンパッドの端を探すことによって、より速く行うことができます。コーラー照明用のコンデンサを調整します。
    3. イメージング パラメータを設定します。遅延ステージが正しい数値に表示されているかどうかを確認します。ポンプビーム波長を795.8 nmに設定します。IRセンサーカードとIRビューアを使用して、ポンプビームパスが正しいかどうかを確認します。
    4. ピコ秒システムのコントロールパネルでポンプビームのパワーを200mW、ストークスビームを400mWに設定します。
      注: レーザー出口から 2 つのビームのポスト目標までのレーザースループットは、ポンプで約 25%、このシステムセットアップでは Stokes の場合は 14% です。したがって、ポンプビームのポスト目標電力は約50mWであり、ストークスビームの場合は約56mWです。最近のピコ秒レーザーシステムのパルス幅は6 psから2 psに変化し、したがって、適用されるレーザーパワーはさらに低くなるはずです。
    5. ロックインアンプゲインを最大に設定します。両方のビームのシャッターとレーザーのメインシャッターを開きます。
    6. サンプルをスキャンし、コンピュータ画面上の画像を確認します。イメージングソフトウェアで表示モードを Hi-Lo に変更します。範囲を調整して、約 50% の彩度を表示します。彩度が画像の中央に配置されているかどうかを確認します。ない場合は、慎重にステアリングミラー、M1とM2を調整し、画像の強度を最大化し、ピーク強度を中央にします。
    7. 遅延ステージを微調整し、ドデカンサンプルから最大SRS信号強度を見つけます。システムは、使用する準備が整いました。

2. SRS顕微鏡イメージング用 のC.エレガンス サンプルの調製

注:モデル生物として、カエノハブディティスエレガンスは、複数のイメージング技術に非常に有用であることが証明されています。それらは全身透明であり、従って解剖を必要とせずに無傷の動物の中でさまざまなティッシュをイメージすることができる。C.エレガンスでは、中性脂質が腸内に位置する脂質滴に保存され、腸管腔16の周囲に20個の上皮細胞が20個存在する。皮下細胞および卵母細胞はまた脂質を貯え込む。C.エレガンス脂質滴における貯蔵脂質の主な形態は、トリアシルグリセロール(TAG)17であり、脂肪酸鎖に存在するCH2結合の豊富さによる強力なSRSシグナルを生成する。このセクションでは、SRS顕微鏡イメージングとそれらの全腸脂質貯蔵レベルの定量化のためのC.エレガンスサンプルを調製する方法に焦点を当てます。

  1. イメージングスライドの準備
    1. まず、蒸留したH2Oで2%アガロース溶液を調製し、アガロースパッドを調製する前にすべてのアガロースが溶けていることを確認します。
    2. 2層のラボ用テープを使用してサポートスライドの間に配置されるブランクスライド(約100μL)に、暖かい2%アガロースを1滴追加し、1枚目のスライドの上に素早く2枚目のスライドを配置します。やさしく押して、薄いアガロースパッドを作ります。
    3. これらのスライドは閉じた位置に置き、ワームをマウントする準備ができるまで分離しないでください。パッドは1日後に乾燥するので、各イメージングセッションの前に新鮮なスライドを準備します。
      注:ハイスループットの遺伝的スクリーン18で複数のワームをイメージングする場合は、マルチウェルイメージングチャンバを使用してください。ライブイメージング設定を使用して、発達と老化を通じて脂質代謝の時空間的ダイナミクスを画像化する。
  2. ワームのマウント
    1. M9バッファーにアジドナトリウムまたはレバミゾールを加えて、麻酔剤を最終濃度の100mMまたは1mMにそれぞれ添加して調製します。
      注:遺伝的スクリーン後のジェノタイピングのためにイメージング後にワームを回収する必要がある場合は、レバミソールを使用してください。
      注意:アジドナトリウムやレバミゾールを含むいくつかの麻酔剤は、吸入すると有害である。保護手袋と衣類を着用し、これらの作業ソリューションを準備する際に化学発煙フードを使用してください。
    2. 麻酔剤をカバースリップに一滴置きます(10~20ワームの場合は約4~5μL)。
      注: ワームの数に応じて麻酔エージェントの量を調整し、ワームをできるだけ近くに保ちます。いくつかのワームのためにあまりにも多くの液体を使用すると、ワームがアガロースパッドに広がる原因となる可能性があります。
    3. 解剖顕微鏡の下で画像化されるワームを選び、麻酔剤の液滴に移します。すべてのワームをドロップレットに追加したら、ワームピッカーを使用してワームを動かし、それらが互いに重ならないようにします。
    4. ガラススライドを(ステップ2.1から)分離し、アガロースパッドを摂動させることなく。
    5. アガロースパッドを備えたガラススライドでワーム液滴を覆います。アガロースパッドがワームに向かっていることを確認してください。あるいは、麻酔老化液滴をアガロースパッドに加えることができ、ワームはカバースリップで覆うことができる。
    6. 最後に、ガラススライド上の永久的なマーカーを使用してワームの位置をマークします。

3. 画像の取得と解析

  1. SRS顕微鏡システムを使用して画像を取得します。
    1. サンプルをイメージングする前に、イメージングパラメータを決定し、SRS信号を検証します(プロトコル1で説明)。
    2. カバースリップを対物レンズに向けてスライドに取り付けます。明るいフィールド光源をオンにし、接眼部に向け、ワームを見つけます。
      注:腸全体の脂質貯蔵を画像化するには、20倍の対物レンズを使用してください。60x対物レンズを使用して、皮下脂肪の貯蔵を画像化したり、脂質の液滴サイズ/数を定量化することを検討してください。
    3. ワームに焦点を当て、それに応じてコンデンサーの位置を調整します。
    4. 明視野光源をオフにして、レーザースキャンユニットに切り替えます。高速スキャン速度(例えば、512 x 512ピクセル)で最初のワームのスキャンを開始し、関心のある領域を見つけるために細かい焦点を調整します。最初のサンプルを画像化するには、SRS 信号が飽和していないレベルにレーザーパワーを調整します。
    5. SRS画像を得るために、より遅いスキャン速度(例えば、2μs/ピクセル)およびより高い解像度(例えば、1024 x 1024ピクセル)に切り替えます。
      注: イメージング セッション中に画像を撮るすべてのサンプルのレーザーパワーを一定に保ちます。
    6. 高解像度 (.tiff ファイルなど) を可能にする目的の形式で SRS イメージを保存します。使用するイメージングソフトウェアとセットアップに応じて、次のワームに移動する前に最初のワームの場所を保存します。
    7. スライドにマウントされたすべてのワームの完全なイメージング。シャッターを切ってレーザー光線を遮断します。すべてのサンプルが画像化されるまで、レーザー光源をオフにしないでください。
    8. 次のサンプル スライドを配置する前にスライドを削除します。ステップ 3.1.2 ~ 3.1.7 を繰り返します。
    9. すべてのサンプルを画像化したら、レーザー光源をスタンバイ状態にし、アンプ、検出器、顕微鏡、コンピュータなどの関連機器の電源を切ります。
  2. ImageJを用いた画像の解析
    1. ImageJ で定量化するイメージ ファイル (通常は.tiff) を開くには、ファイルを選択して ImageJ ウィンドウにドラッグ アンド ドロップします。特定のオリンパス顕微鏡形式(.oibファイルなど)を使用する場合は、適切なImageJプラグインをダウンロードします。
    2. 分析するプロパティを選択します ([測定の分析 > 測定を設定する)] 。脂質の全量定量については、 面積、最小および最大グレー値、 および 平均グレー値を選択します。
    3. ポリゴン選択ツールを使用し、定量化するワーム腸の領域を概略化します。ステップ 3.2.2 で選択したパラメータを測定するには、[メジャーの分析] >クリックします。測定結果が表示された新しいウィンドウがポップアップ表示されます。開いているすべてのイメージに対してこの手順を繰り返します。
    4. 特定の遺伝子型のすべてのワームの測定値を選択し、その結果を新しいスプレッドシートにコピー/ペーストします。同じイメージングセッション内のすべての遺伝子型について、手順 3.2.1 ~ 3.2.4 を繰り返します。
    5. SRS シグナルのないワームの近傍の領域を選択し、背景として数値化します。バックグラウンド測定用に選択した領域に、SRS信号を与える可能性のある細菌や破片が含まれていないことを確認してください。
    6. 個々のワームの測定値から背景平均グレー値を引きます。特定の遺伝子型/テストグループ内のすべてのワームから、背景の平均値と平均グレー値を計算します。この値をコントロール グループの平均に正規化します。
    7. 最後に、各ワームの脂質レベルの尺度として、平均グレー値を用いて適切な統計解析を行う。通常、2 つのグループに対して Student の t-testを使用し、3 つ以上のグループに対して適切な多重比較テストを行う一方向の ANOVA を使用します。
      注: 図の表示用に画像を選択する場合は、選択した画像のピクセル強度分布が同じであることを確認します。同じ図のすべての画像に同じ値を設定します(画像>>明るさとコントラストを調整してください)。

結果

インスリンシグナル伝達は、発達、生殖、寿命、代謝に影響を与える重要な内分泌経路である。ワームにおいて、インスリンシグナル伝達は、約40種類のインスリン様ペプチドリガンド、インスリン様成長因子受容体オルソログDAF-2、下流PI3K/AKTキナーゼカスケード、及びFoxO転写因子オルソログ、DAF-1620からなる。daf-2変異体は、インスリン受容体を欠いている、それ?...

ディスカッション

肥満およびそれに関連する代謝障害に対する防御において、脂質恒常性の調節機構をよりよく理解するための重要な研究努力が実施されている。生体試料中の脂質分子の定量的検出では、SRS顕微鏡による標識のないイメージングが、生化学的アッセイやその他の染色法に代わる信頼性の高い方法であることが証明されています。我々のグループ及び他の人々は、C.エレガンスとSRS顕微?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、NIH助成金R01AG045183(M.C.W.)、R01AT009050(M.C.W.)、R01AG062257(M.C.W)によってサポートされました DP1DK113644(M.C.W.)、ダイムズ財団の行進(M.C.W.)、ウェルチ財団(M.C.W.)、HHMI調査官(M.C.W.)。私たちは 、C.エレガン ス株のためのカエノハブディティス遺伝学センター(CGC)に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
A/D converterOlympusAnalog Unit
AgaroseGeneMate3119For making agarose pads
Alignment tool - adapterThorlabsSM1A4For mounting the tool on scope
Alignment tool - targetThorlabsVRC2SM1For viewing IR laser
Alignment tool - tubeThorlabsSM1L40Length can vary
Autocorrelator (Optional)APEpulseCheck
Bandpass filterminicircuitsBBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHzFor signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscopeNikonSMZ800For handling and picking worms for imaging
DodecaneSigma-Aldrich44010Used for calibration of the SRS signal
FilterChroma Technology890/220 CARSFor removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tapeVWR89097For making agarose pads
Glass coverslipsVWR48393-106For covering worms for imaging
Glass microscope slideVWR16004-422For making agarose pads
Laser scanning microscopeOlympusFV3000
LensThorlabsL1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		For beam expander
Lock-in amplifierZurichHF2LI
Lowpass filterminicircuitsBLP-1.9+For power supply noise suppression
MirrorsThorlabsBB1-E03For relay and periscope
ObjectiveOlympusUPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
PhotodiodeThorlabsFDS1010
Picosecond laser sourceAPEpicoEmerald
Power supplyTEKPOWERTP1342UFor photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azideSigmaS2002For anaesthesizing the worms
Worm pickerWormStuff59-AWP

参考文献

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