Complementazione dell'attività di splicing da parte di un complesso snRNP Galectin-3 - U1 su perline

I classici esperimenti di deplezione-ricostituzione indicano che la galectina-3 è un fattore di giunzione richiesto negli estratti nucleari. Il meccanismo di incorporazione della galectina-3 nella via di giunzione è affrontato in questo documento. La sedimentazione di estratti nucleari di cellule HeLa su gradienti di glicerolo del 12% -32% produce frazioni arricchite in una particella endogena ~ 10S che contiene galectina-3 e U1 snRNP. Ora descriviamo un protocollo per esaurire gli estratti nucleari di U1 snRNP con concomitante perdita di attività di splicing. L'attività di splicing nell'estratto impoverito di U1 può essere ricostituita dalla particella galectina-3 - U1 snRNP intrappolata su perle di agarosio accoppiate covalentemente con anticorpi anti-galectina-3. I risultati indicano che il complesso ternario galectina-3 - U1 snRNP - pre-mRNA è un complesso E funzionale che porta a intermedi e prodotti della reazione di splicing e che la galectina-3 entra nella via di splicing attraverso la sua associazione con U1 snRNP. Lo schema di utilizzo di complessi affinati o immunoselezionati su perline per ricostituire l'attività di giunzione in estratti impoveriti di uno specifico fattore di giunzione può essere generalmente applicabile ad altri sistemi.