ベーカー酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアゲノム発現産物の表示と可視化

ミトコンドリアは、好気性呼吸が可能な真核細胞の必須のオルガネラである。それらは円形ゲノムおよび遺伝子発現装置を含んでいる。ベーカー酵母のミトコンドリアゲノムは8つのタンパク質をコードする:シトクロムcオキシダーゼの3つのサブユニット(Cox1p、 Cox2p、およびCox3p)、ATPシンターゼ(Atp6p、Atp8p、およびAtp9p)の3つのサブユニット、ユビキノールシトクロムcオキシド還元酵素のサブユニット、シトクロムb(シtb)、およびミトコンドリアリボソームタンパク質Var1p。ここで説明する方法の目的は、これらのタンパク質を ^35Sメチオニンで特異的に標識し、電気泳動によってそれらを分離し、画面上の離散バンドとして信号を視覚化することである。この手順には、いくつかの手順が含まれます。まず、酵母細胞は、ガラクトース含有培地で、対数後期増殖段階に達するまで培養される。次に、シクロヘキシミド処理は細胞質翻訳をブロックし、ミトコンドリア翻訳産物でのみ ^35Sメチオニンの組み込みを可能にする。次に、すべてのタンパク質を酵母細胞から抽出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。最後に、ゲルを乾燥させ、蓄電池蛍光体スクリーンでインキュベートする。スクリーンはリンイメージャーでスキャンされ、バンドが明らかになります。この方法は、変異酵母株と野生型のミトコンドリアにおける単一ポリペプチドの生合成速度を比較するために適用することができ、これはミトコンドリア遺伝子発現欠陥の研究に有用である。このプロトコルは、全酵母ミトコンドリアmRNAの翻訳速度に関する貴重な情報を提供します。しかし、適切な結論を出すためには、いくつかの制御と追加の実験が必要です。