이 작품은 독일 과학 재단 (DFG)에서 공동 연구 센터 (SFB) 1032에 보조금에 의해 지원되었다. 독일 연방 교육기술부(BMBF)의 협력 프로젝트 05K2018-06716 메디소프와 바이에리슈 포르스스티퉁의 보조금에 감사하게 인정받고 있다. 아니타 라이저는 정량적 생물 과학 뮌헨 (QBM)의 대학원을 통해 DFG 펠로우십에 의해 지원되었다.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62025/62025fig02.jpg"> 그림 2: 단일 세포 마이크로 어레이 (A)와 스캔 시간 경과 현미경 검사 (B)를 결합한 데이터 수집. 시간 경과 실험의 준비로서, 접착 사각형의 2D 마이크로패턴을 가진 단일 세포 어레이가 제조(1), 세포 파종 및 마이크로패턴(2)에 세포의 정렬뿐만 아니라 6채널 슬라이드에 관류 시스템의 연결, 이는 시...

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	<li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+do+differences+make+a+difference.">Cellular heterogeneity: do differences make a difference.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li><li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+method+to+generate+multiple+types+of+micropatterns.">Versatile method to generate multiple types of micropatterns.</a> Biointerphases. 11 (1), 011005 (2016).</li><li>Piel, M., Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micropatterning in cell biology, part A/B/C. , (2014).</li><li>Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., R&#228;dler, J. 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MIAAB, 29262 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama">https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama</a> (2020)</li><li>Reiser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+delivery+timing+and+protein+expression+in+lipid-based+transfection.">Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection.</a> Integrative Biology. 11 (9), 362-371 (2019).</li><li>Reiser, A., Wosch&#233;e, D., Mehrotra, N., Krzyszto&#324;, R. S., Strey, H. H., R&#228;dler, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplementing+data+and+code+for:+"Correlation+of+mRNA+delivery+timing+and+protein+expression+in+lipid-based+transfection".">Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection".</a> Zenodo. , (2019).</li><li>Ferizi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+analysis+of+chemically+modified+mRNA+using+micropattern-based+single-cell+arrays.">Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3561-3571 (2015).</li><li>Fr&#246;hlich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-experiment+nonlinear+mixed+effect+modeling+of+single-cell+translation+kinetics+after+transfection.">Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection.</a> NPJ systems biology and applications. 4 (1), 1-12 (2018).</li><li>Krzyszto&#324;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+kinetics+of+siRNA-mediated+mRNA+degradation.">Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077 (2019).</li><li>R&#246;ttgermann, P. J., Alberola, A. P., R&#228;dler, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-organization+on+micro-structured+surfaces.">Cellular self-organization on micro-structured surfaces.</a> Soft Matter. 10 (14), 2397-2404 (2014).</li><li>R&#246;ttgermann, P. J., Dawson, K. A., R&#228;dler, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+study+of+nanoparticle+induced+apoptosis+using+microfabricated+single+cell+arrays.">Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays.</a> Microarrays. 5 (2), 8 (2016).</li><li>Murschhauser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microscopy+method+for+single-cell+analysis+of+event-time+correlations+in+nanoparticle-induced+cell+death.">A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-11 (2019).</li><li>Chatzopoulou, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+platform+for+dynamic+analysis+of+NK+cell+cytolysis+mediated+by+a+triplebody.">Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody.</a> Analyst. 141 (7), 2284-2295 (2016).</li><li>Sztilkovics, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+adhesion+force+kinetics+of+cell+populations+from+combined+label-free+optical+biosensor+and+robotic+fluidic+force+microscopy.">Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li></ol>

여기서 우리는 LISCA를 단세포 수준에서 세포내 형광 라벨의 세포 역학을 따르는 다목적 기술로 기술했습니다. 성공적인 LISCA 실험을 수행하려면 프로토콜 섹션의 각 설명된 단계를 개별적으로 수립해야 하며 모든 단계를 결합해야 합니다. LISCA의 세 가지 주요 측면은 각각 중요한 단계를 특징으로합니다.
단세포 마이크로어레이 제작 마이크로어레이의 셀룰러 정렬은 ...

최근 몇 년 동안, 단세포 실험의 중요성이 명백해지고 있다. 단일 세포로부터의 데이터는 세포 대 세포 가변성, 세포 내 파라미터 상관관계의 해상도 및 앙상블 측정1,2,3에숨겨져 있는 세포 역학의 검출을 조사할 수 있다. 수천 개의 단일 세포의 세포 역학을 병렬로 조사하기 위해서는 수 시간까지 며칠 동안 표준화된 조건하에서 세포를 모니터링할 수 있도록 하는 새로운 접근법이 필요하며, 이어서 정량적 데이터 분석 4. 여기서는 미세구조화 어레이의 사용과 시간 경과 현미경 검사및 자동화된 이미지 분석을 결합한 단일 셀 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징을 소개합니다.
미세 구조화 된 단세포 어레이를 생성하기위한 몇 가지 방법이 수립되어 문헌5,6에출판되었다. 여기에서, 우리는 마이크로 스케일 플라즈마 개시 단백질 패턴화 (μPIPP)를 간단히 설명합니다. μPIPP를 이용한 단일 세포 어레이 제조의 상세한 프로토콜도 참조7에서발견된다. 단일 세포 어레이의 사용은 표준화된 접착 반점에 수천 개의 셀의 정렬을 가능하게 하여 각 세포에 대해 정의된 마이크로환경을 제시하여 실험적 가변성의 근원을 감소시킵니다(그림1A). 단일 세포 배열은 다양한 세포 과정을 나타내기 위해 목적으로 사용되는 형광 마커의 시간 과정을 모니터링하는 데 사용됩니다. 스캔 시간 경과 모드에서 장기 현미경 검사는 단일 셀 어레이의 넓은 영역을 모니터링하고 따라서 몇 시간 또는 며칠의 관측 시간에 걸쳐 높은 처리량의 단일 세포 데이터를 샘플링 할 수 있습니다. 이렇게 하면 배열의 각 위치에서 이미지의 시간 줄스택(그림 1B)이생성됩니다. 다량의 영상 데이터를 줄이고 원하는 단일 세포 형광 시간 과정을 효율적인 방법으로 추출하기 위해서는 셀의 위치지정(도 1C)을활용하는 자동화된 이미지 처리가 요구된다.
LISCA의 과제는 실험 프로토콜과 계산 도구를 조정하여 세포 역학의 정량적이고 재현 가능한 데이터를 생성하는 높은 처리량 분석기를 형성하는 것입니다. 이 문서에서는 개별 메서드와 LISCA 분석기에서 결합하는 방법에 대한 단계별 설명을 제공합니다. 예를 들어, 인공 mRNA 전달 후 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP) 발현의 시간 과정에 대해 논의합니다. mRNA 전달 에 따른 eGFP 발현은 mRNA의 번역 및 분해를 모델링하는 반응 속도 방정식에 의해 설명된다. 시간이 지남에 따라 각 개별 셀에 대한 형광 강도의 LISCA 판독값에 eGFP 농도의 시간 과정에 대한 모델 기능을 피팅하면 mRNA 분해 속도와 같은 모델 파라미터의 가장 좋은 추정치를 산출합니다. 대표적인 결과로 우리는 두 개의 다른 지질 계 형 경화 에이전트의 mRNA 전달 효율과 매개 변수 분포가 어떻게 다른지에 대해 논의합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62025/62025fig01.jpg"> 그림 1: LISCA 워크플로우의 표현 (A) 마이크로 패턴 단일 셀 어레이 (B) 스캔 시간 경과 현미경 및 (C) 기록 된 이미지 시리즈의 자동화 된 이미지 분석. 단세포 어레이는 세포-발충제 간 공간을 가진 세포-접착제 사각형의 2차원 패턴으로 구성되어 마이크로패턴상에 있는 세포의 배열로 이어지는데, 이는 상 대비 영상뿐만 아니라 eGFP 발현 세포의 형광 이미지에서 볼 수있다(A). 전체 미세 구조화 영역은 반복적으로 위치의 시퀀스에서 이미지를 촬영 스캔 시간 경과 모드에서 이미지(B). 기록된 이미지 시리즈는 시간이 지남에 따라 세포당 형광 강도를판독하기 위해 처리된다(C). 스케일 바: 500 μm(A),200 μm(C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62025/62025fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10178071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>baking oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9010-0190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Fluor DL 10x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Roth</td>
			<td>NX07.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP mRNA</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>L-7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer to Tube Connector</td>
			<td>MEDNET</td>
			<td>FTL210-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Yo Proteins</td>
			<td>663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set eGFP</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F46-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11768088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Box</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>OKO-H201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in-house fabricated consisting of teflon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to Tube Connector</td>
			<td>MEDNET</td>
			<td>MTLS210-6005</td>
			<td>alternative to in-house fabricated male luers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needleless Valve to Male Luer Connector</td>
			<td>MEDNET</td>
			<td>NVFMLLPC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software Version 5.02.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO</td>
			<td>pco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in-house prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener Femto</td>
			<td>Pico-BRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)</td>
			<td>SuSoS AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon wafer mit mircorstructures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in-house fabricated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sticky slide VI 0.4&#160;</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tango 2</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user</td>
			<td>00-24-626-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in-house prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uncoated coverslips</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt-F Solo, 1 mL</td>
			<td>Omilab</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>with replacement sporn</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of single-cell arrays (lisca) - a versatile technique to quantify cellular kinetics

단일 세포 배열의 라이브 셀 이미징 (LISCA)는 높은 처리량의 개별 세포로부터 형광 신호의 시간 과정을 수집하는 다양한 방법입니다. 일반적으로, 배양 된 세포에서 단세포 시간 과정의 취득은 세포 운동성 및 세포 모양의 다양성에 의해 방해된다. 접착제 마이크로 어레이는 단일 셀 조건을 표준화하고 이미지 분석을 용이하게 합니다. LISCA는 단일 셀 마이크로어레이와 스캔 시간 경과 현미경 검사및 자동화된 이미지 처리를 결합합니다. 여기서는 LISCA 형식으로 단일 세포 형광 시간 과정을 취하는 실험 단계를 설명합니다. 당사는 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 위해 mRNA 인코딩을 사용하여 마이크로패턴 어레이에 부착된 세포를 트랜스펙트하고 스캔 시간 경과 현미경 검사를 통해 수백 개의 세포의 eGFP 발현 운동을 병렬로 모니터링합니다. 이미지 데이터 스택은 선택한 셀 윤곽에 형광 강도를 통합하여 단일 세포 형광 시간 과정을 생성하는 새로 개발된 소프트웨어에 의해 자동으로 처리됩니다. 우리는 mRNA 이식 후 eGFP 발현 시간 과정이 mRNA의 발현 및 저하 율을 드러내는 간단한 운동 번역 모델에 의해 잘 설명된다는 것을 보여줍니다. 사멸 신호의 맥락에서 여러 마커의 이벤트 시간 상관 관계에 대한 LISCA의 추가 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

LISCA 접근 은 단일 세포에서 형광 시간 과정을 효율적으로 수집 할 수 있습니다. 대표적인 예로, LISCA 메서드가 트랜스펙트 후 단일 셀 eGFP 식을 측정하기 위해 어떻게 적용되는지 설명합니다. LISCA 실험의 데이터는 효율적인 mRNA 약물의 발달에 중요한 mRNA 전달 운동학을 평가하기 위해 사용됩니다.
특히 우리는 단일 세포 수준에서 번역 개시 및 발현 속도에 대하여 2개의 지질 계...

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Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays LISCA - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high ...

LISCA에게 불린 단하나 세포 배열의 살아있는 세포 화상 진찰은 또한 개별적인 세포의 수백의 형광 시간 과정의 자동화된 판독입니다. 접근의 장점은 개별 세포 반응이 동일 마이크로 환경에서 공간적으로 고립된 세포에서 기록되어 훌륭한 통계를 가진 효율적인 방출 분석을 허용한다는 것입니다. 단일 셀 어레이를 제작하려면 메스를 사용하여 PDM 층에서 6 개의 마이크로 파우더 스트라이프가 들어있는 단일 PDM 걸작을 자르고 마이크로 패턴이 위로 향하는 실험실 벤치에 걸작을 배치하십시오.면도날을 사용하여 6개의 마이크로패턴 줄무늬를 각각 PDM 스탬프로 잘라패턴 영역 중 일부를 잘라 스탬프의 가장자리가 열려 있는지 확인합니다. 다음으로, 6개의 챔버 슬라이드의 커버 슬립의 보호 호일을 조심스럽게 긁어 슬라이드의 채널 위치를 표시하고 보호 호일을 내려다 보고 있는 벤치에 덮개 슬립을 놓습니다. 핀셋을 사용하여 표시된 채널 위치에 스탬프를 부착하고 마이크로 패턴을 아래로 향하고 현미경으로 스탬프부착을 확인하십시오.슬라이드와 접촉하는 사각형은 인터스페이스보다 더 어둡게 나타납니다. 슬라이드에 제대로 부착되지 않은 사각형에 의해 패턴 품질이 저하됩니다. 스탬프가 단단히 부착된 경우 커버 슬립과 산소 플라즈마가 있는 우표를 0.2밀리바의 압력과 약 40와트의 우표를 3분 동안 치료하여 PDM 우표와 커버 슬립 친성 사이의 표면을 만듭니다.플라즈마 세척의 끝에서, 커버 슬립을 생물 안전 캐비닛에 넣고 각 스탬프에 페기폴드 폴리 l-lysine 용액 15 마이크로리터를 추가하여 용액이 스탬프의 친수성 패턴으로 흡수되도록 합니다. 20분 후, 초순수 한 밀리리터로 우표를 헹구는 다. 핀셋을 사용하여 슬라이드에서 우표를 제거하고 초순수의 두 번째 밀리리터로 두 번째로 커버 슬립을 헹구십시오.커버 슬립이 완전히 건조되면 6개의 채널 끈적끈적한 슬라이드를 커버 슬립에 부착하여 마이크로 패턴 영역이 채널의 바닥과 정렬되는 것을 주의하십시오. 또한 각 채널에 PBS 40 마이크로리터와 40마이크로리터의 fibronectin 용액을 추가합니다. 두 개의 솔루션을 혼합하려면 한 저장소에서 40 마이크로리터를 제거하고 동일한 채널의 반대 저장소에 세 번 추가하여 균일한 용액을 생성합니다.모든 채널이 혼합되면, 세차당 PBS의 120 마이크로 리터와 각 채널을 세 번 세척하기 전에 실온에서 45 분 동안 슬라이드를 배양. PBS를 섭씨 37도로 교환하고, 1개의 저수지에 120 마이크로리터 배지를 추가하여 채널내 세포 성장 배지를 완전히 보충하고 반대 저수지에서 제거한다. 각 채널에 400, 000 셀의 마이크로리터를 관심 정지 및 40 마이크로리터의 셀 성장 배지를 각 채널에 추가하고, 입증된 바와 같이 세포 용액을 배지와 혼합한다.혼합 후 각 채널에서 40 마이크로리터의 서스펜션을 제거하여 채널만 셀 서스펜션으로 채워지도록 하고 슬라이드를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 1시간 후, 위상 조영 현미경검사법에 의한 세포 접착력을 확인하고, 각 채널에 섭씨 37도의 마이크로리터 120을 추가한 다음, 슬라이드를 세포 배양 인큐베이터로 3시간 더 돌려보세요. 관류 시스템을 설정하려면 37°C의 세포 성장 배지로 채워진 1밀리리터 주사기를 시스템의 입구 튜브에 연결하고 밸브를 사용하여 튜브를 매체로 채웁니다.입구 튜브를 한 채널의 저장소에 연결하여 기포가 갇히지 않도록 주의하고, 현재 채널의 입구 튜브 맞은편에 있는 저수지에 직렬 커넥터를 연결합니다. 필요한 수의 채널이 연이어 연결될 때까지 설명된 대로 나머지 채널을 연결합니다. 그리고 출구 튜브를 최종 채널의 자유 저수지에 직접 연결합니다.그런 다음 커넥티드 튜브를 매체로 채우면 관류 시스템이 누출되지 않는지 확인합니다. 세포의 시간 경과 이미징의 경우, 위상 대비 영상과 형광 이미지를 기록하기 위한 타임랩스 프로토콜을 설정하려면 위상 대비 이미징 및 형광 이미징을 위한 광학 구성을 설정합니다. 10배의 목표, 적절한 형광 필터 및 자동화된 초점 보정 시스템을 사용하여 장기적인 측정을 위한 더 나은 화질을 보장합니다.단계 대비 이미징에 대해 10밀리초 노출 시간을 선택하고 EGFP 형광 강도를 기록하기 위한 750밀리초 노출 시간을 선택합니다. 위치 목록을 통해 연속 루프와 30 시간의 관찰 시간 사이의 10 분 시간 간격으로 시간 일정을 설정합니다. 다음으로, 현미경의 섭씨 37도 가열 챔버의 샘플 홀더에 단일 지하실 인상에 6 개의 채널을 놓고 무대에 관류 시스템 튜브를 테이프.15 밀리리터 원판 튜브에 콘센트 튜브의 자유 끝을 삽입하여 액체 폐기물을 수집합니다. 그리고 스캐닝 타임랩스 측정을 위한 위치 목록을 설정하고, 위치 목록을 통해 연속 루프 사이의 정의된 시간 간격 내에서 위치 수를 스캔할 수 있다는 점을 주의한다. 그런 다음 시간 경과 측정을 시작합니다.형광 마커를 가진 세포의 회전을 위해, 현미경 단계가 움직이지 않는 것을 주의해서, 37섭씨 PBS의 1 밀리리터로 튜브 시스템을 플러시하는 주사기를 사용하십시오. 플러싱 후, 300 마이크로리터의 혈청 감소 배지로 시스템을 채우고, 마이크로리터 당 0.5 나노그램의 mRNA의 최종 농도로, 리포플렉스가 1시간 동안 배양할 수 있도록 한다. 인큐베이션의 끝에서, 어떤 unbound mRNA를 제거하기 위해 섭씨 37도의 1 밀리리터로 시스템을 플러시 완전한 세포 성장 매체.분석이 끝나면 채널 메뉴에 나열된 채널을 보고 시간 프레임을 스크롤하여 미리 선택된 셀과 통합형 형광 신호를 검사합니다. 관심 있는 셀을 클릭하여 형광 시간 과정을 강조하거나 시간 코스를 클릭하여 해당 셀을 찾습니다. 셀을 클릭하는 동안 이동을 눌러 셀을 선택하거나 선택 해제합니다.실행 가능하지 않거나 접착 지점에 국한되지 않거나 다른 셀에 부착된 셀을 선택 해제하여 추가 분석에서 제외합니다. 모든 셀을 적절히 선택하거나 선택 해제하면 세포 영역 및 통합형 형광에 대한 단일 셀 시간 과정을 적절한 디렉터리에서 저장합니다. 전환 후 번역 개시 시간을 정량화하고, 셀룰러 EGFP 표현의 강도, 3단계 번역 모델을 사용할 수 있다.EGFP용 모델 솔루션은 그림과 같이 단일 셀 시간 과정에 장착할 수 있습니다. 여기서, 리포플렉스 전멸 세포의 번역 개시 시간 및 발현 속도의 히스토그램이 관찰될 수 있다. 두 매개 변수가 각 세포에 대해 추정되기 때문에, 이러한 파라미터의 상관관계는 산란 된 플롯에서 입증된 바와 같이 분석될 수 있으며 지질 나노 입자로 감염된 세포와 비교할 수 있습니다.그림과 같이, 지질 나노 입자로 전이된 세포는 lipoplexes로 전과 감염된 세포에 비해 세포 간 가변성이 적습니다. 그리고 인구 평균은 더 빠른 번역 개시뿐만 아니라 더 높은 발현률을 보여줍니다. 우리의 접근 방식은 또한 다른 마이크로 패터닝 방법에 적응할 수 있습니다.LISCA에 가장 중요한 것은 좋은 세포 감금과 편리한 사용자 감독과 자동화 된 이미지 분석의 조합입니다. 당신이 본 바와 같이, 세포 행동은 이질적이다. 그리고 단세포 타임랩스 영화는 내재된 생화학 네트워크의 편견없는 역학에 대한 액세스를 제공합니다.예를 들어 녹색 표현식, 세포 멸망 또는 세포 살인 에세이에서.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

Abstract