Test de fuite fluorescente pour étudier la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules

Les peptides pénétrant dans les cellules (CPP) sont définis comme des transporteurs capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules. L’une des principales caractéristiques communes requises pour cette activité résultait des interactions des CPP avec la membrane plasmique (lipides) et plus particulièrement avec les composants de la matrice extracellulaire de la membrane elle-même (sulfate d’héparane). En effet, indépendamment de la translocation directe ou de l’internalisation dépendante de l’endocytose, les bicouches lipidiques sont impliquées dans le processus d’internalisation tant au niveau de la membrane plasmique qu’au niveau du trafic intracellulaire (vésicules endosomales). Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé décrivant les différentes étapes de la formulation, de la purification, de la caractérisation et de l’application d’une grande vésicule unilamellaire (LV) dans le test de fuite de fluorescence afin de détecter une éventuelle déstabilisation/interaction CPP-membrane et d’aborder leur rôle dans le mécanisme d’internalisation. Des LV avec une composition lipidique reflétant la teneur en membrane plasmique sont générés afin d’encapsuler à la fois un colorant fluorescent et un quencher. L’ajout de peptides dans le milieu extravésiculaire et l’induction d’interactions peptide-membrane sur les LV pourraient ainsi induire de manière dose-dépendante une augmentation significative de la fluorescence révélant une fuite. Des exemples sont fournis ici avec les peptides amphipathiques (W) riches en tryptophane (W) et en arginine (R) récemment développés, qui ont montré une administration rapide et efficace de siRNA dans diverses lignées cellulaires. Enfin, la nature de ces interactions et l’affinité pour les lipides sont discutées pour comprendre et améliorer la translocation membranaire et/ou l’échappement endosomal.