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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Abstract

Os peptídeos de penetração celular (CPPs) são definidos como portadores capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para as células. Uma das principais características comuns necessárias para esta atividade resultou das interações de CPPs com a membrana plasmática (lipídios) e mais particularmente com componentes da matriz extracelular da própria membrana (sulfato heparan). De fato, independente da translocação direta ou da internalização dependente da endócita, bicamadas lipídicas estão envolvidas no processo de internalização tanto no nível da membrana plasmática quanto no nível de tráfego intracelular (vesículas endossomais). Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo as diferentes etapas de uma grande formulação de vesículas unilamellar (LUVs) formulação, purificação, caracterização e aplicação no ensaio de vazamento de fluorescência, a fim de detectar possível desestabilização/interação da membrana CPP e abordar seu papel no mecanismo de internalização. LUVs com uma composição lipídica refletindo o teor da membrana plasmática são gerados a fim de encapsular tanto um corante fluorescente quanto um saciador. A adição de peptídeos no meio extravesicular e a indução de interações peptídeo-membrana nos LUVs podem, assim, induzir de forma dependente de dose um aumento significativo da fluorescência revelando um vazamento. Exemplos são fornecidos aqui com o recém-desenvolvido triptofano (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAPs), que mostraram uma entrega rápida e eficiente de siRNA em várias linhas celulares. Finalmente, discute-se a natureza dessas interações e a afinidade com os lipídios para entender e melhorar a translocação da membrana e/ou a fuga endossomal.

Introduction

Após sua descoberta nos anos noventa, peptídeos penetrantes por células (CPPs) foram desenvolvidos para promover uma entrega celular eficiente de cargas através da membrana plasmática1,2. CpPs são geralmente peptídeos curtos, geralmente de 8 a 30 aminoácidos, tendo uma grande variedade de origens. Eles foram definidos pela primeira vez como portadores de "translocação direta", o que significa que eles foram capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para células independentemente de qualquer via endocítica, nem exigência de energia nem envolvimento receptor. No entanto, investigações po....

Protocol

1. Preparação de Grandes Vesículas Unilamellar (LUVs)

  1. Prepare luvs para seu uso como mímica de membrana celular para ensaio de vazamento de fluorescência.
  2. Misture com uma fosfardolina de vidro Hamilton (DOPC, 786,11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) e Colesterol (Chol, 386,65 g/mol) na razão molar 4:4:2. A solução lipídica é obtida a partir de uma solução de estoque de cada lipídio solubilizado em um solvente de fundo redondo de metanol/clorofórmio (3/1; volume/volume) a 25 mg/mL em um frasco de vidro de 25 mL de fundo redondo. Com base em 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM e 2 μmol de Chol, a solução lipídica é obtida a partir da solução de estoq....

Representative Results

O princípio do ensaio de vazamento de fluorescência é mostrado na Figura 1. Em detalhes, grandes vesículas unilamellar (LUVs) encapsulando um corante fluorescente e um quencher (sem sinal de fluorescência) são tratados com a biomolécula de interesse. Devido à interação do peptídeo com membranas lipídicas, o que pode implicar permeabilidade da membrana, reorganização ou até mesmo ruptura, o corante de fluorescência e o saciador são liberados d.......

Discussion

O ensaio de vazamento de fluorescência apresentado é um método simples e rápido para lidar com a desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células. Fácil de fazer, também permite uma comparação indireta entre diferentes peptídeos que interagem por membrana ou outras moléculas que interagem por membrana. Quanto às etapas críticas do protocolo, uma vez que este ensaio fornece valores relativos entre a linha de base (SOMENTE LUVs) e a liberação de fluorescência máxima (condição triton), g.......

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Emilie Josse pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela fundação "La Ligue contre le Cancer", a "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer", e o "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
25 mL glass round-bottom flaskPyrex
8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)InvitrogenA350Protect from light 
Chloroform Sigma-Aldrich288306
CholesterolSigma-AldrichC8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)Avanti Polar850375PProtect from air
ExtruderAvanti Polar610000
FluorimeterPTI Serlabo
50 µL glass syringeHamilton705N
HEPESSigma-AldrichH3375
LabAssay Phospholipid WAKO 296-63801
liquid chromatography columnSigma-Aldrich
MethanolCarlo Erba414902
Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter)Whatman800309
polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mmGrener Bio-One614101
polystyrene semi-micro cuvette, DLSFisher ScientificFB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)InvitrogenX1525Protect from light 
quartz fluorescence cuvetteHellma109.004F-QS
rotavapor system HeidolphZ334898
Sephadex G-50 resinAmersham17-0042-01
Sodium azide (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Sodium chlorid (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Sonicator bath USC300TVWR142-6001
SphingomyelinAvanti Polar860062PProtect from air
Triton X-100 Eromedex2000-B
Zetaziser NanoZS MalvernZEN3500

References

  1. Langel, U. . Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).
  2. Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 ....

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