Ensaio de vazamento fluorescente para investigar desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células

Resumo

O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Resumo

Os peptídeos de penetração celular (CPPs) são definidos como portadores capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para as células. Uma das principais características comuns necessárias para esta atividade resultou das interações de CPPs com a membrana plasmática (lipídios) e mais particularmente com componentes da matriz extracelular da própria membrana (sulfato heparan). De fato, independente da translocação direta ou da internalização dependente da endócita, bicamadas lipídicas estão envolvidas no processo de internalização tanto no nível da membrana plasmática quanto no nível de tráfego intracelular (vesículas endossomais). Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo as diferentes etapas de uma grande formulação de vesículas unilamellar (LUVs) formulação, purificação, caracterização e aplicação no ensaio de vazamento de fluorescência, a fim de detectar possível desestabilização/interação da membrana CPP e abordar seu papel no mecanismo de internalização. LUVs com uma composição lipídica refletindo o teor da membrana plasmática são gerados a fim de encapsular tanto um corante fluorescente quanto um saciador. A adição de peptídeos no meio extravesicular e a indução de interações peptídeo-membrana nos LUVs podem, assim, induzir de forma dependente de dose um aumento significativo da fluorescência revelando um vazamento. Exemplos são fornecidos aqui com o recém-desenvolvido triptofano (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAPs), que mostraram uma entrega rápida e eficiente de siRNA em várias linhas celulares. Finalmente, discute-se a natureza dessas interações e a afinidade com os lipídios para entender e melhorar a translocação da membrana e/ou a fuga endossomal.

Introdução

Após sua descoberta nos anos noventa, peptídeos penetrantes por células (CPPs) foram desenvolvidos para promover uma entrega celular eficiente de cargas através da membrana plasmática^1,2. CpPs são geralmente peptídeos curtos, geralmente de 8 a 30 aminoácidos, tendo uma grande variedade de origens. Eles foram definidos pela primeira vez como portadores de "translocação direta", o que significa que eles foram capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para células independentemente de qualquer via endocítica, nem exigência de energia nem envolvimento receptor. No entanto, investigações po....

Protocolo

1. Preparação de Grandes Vesículas Unilamellar (LUVs)

1. Prepare luvs para seu uso como mímica de membrana celular para ensaio de vazamento de fluorescência.
2. Misture com uma fosfardolina de vidro Hamilton (DOPC, 786,11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) e Colesterol (Chol, 386,65 g/mol) na razão molar 4:4:2. A solução lipídica é obtida a partir de uma solução de estoque de cada lipídio solubilizado em um solvente de fundo redondo de metanol/clorofórmio (3/1; volume/volume) a 25 mg/mL em um frasco de vidro de 25 mL de fundo redondo. Com base em 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM e 2 μmol de Chol, a solução lipídica é obtida a partir da solução de estoq....

Resultados

O princípio do ensaio de vazamento de fluorescência é mostrado na Figura 1. Em detalhes, grandes vesículas unilamellar (LUVs) encapsulando um corante fluorescente e um quencher (sem sinal de fluorescência) são tratados com a biomolécula de interesse. Devido à interação do peptídeo com membranas lipídicas, o que pode implicar permeabilidade da membrana, reorganização ou até mesmo ruptura, o corante de fluorescência e o saciador são liberados d.......

Discussão

O ensaio de vazamento de fluorescência apresentado é um método simples e rápido para lidar com a desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células. Fácil de fazer, também permite uma comparação indireta entre diferentes peptídeos que interagem por membrana ou outras moléculas que interagem por membrana. Quanto às etapas críticas do protocolo, uma vez que este ensaio fornece valores relativos entre a linha de base (SOMENTE LUVs) e a liberação de fluorescência máxima (condição triton), g.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mL glass round-bottom flask	Pyrex
8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)	Invitrogen	A350	Protect from light
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)	Avanti Polar	850375P	Protect from air
Extruder	Avanti Polar	610000
Fluorimeter	PTI Serlabo
50 µL glass syringe	Hamilton	705N
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
LabAssay Phospholipid	WAKO	296-63801
liquid chromatography column	Sigma-Aldrich
Methanol	Carlo Erba	414902
Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter)	Whatman	800309
polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm	Grener Bio-One	614101
polystyrene semi-micro cuvette, DLS	Fisher Scientific	FB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)	Invitrogen	X1525	Protect from light
quartz fluorescence cuvette	Hellma	109.004F-QS
rotavapor system	Heidolph	Z334898
Sephadex G-50 resin	Amersham	17-0042-01
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sonicator bath USC300T	VWR	142-6001
Sphingomyelin	Avanti Polar	860062P	Protect from air
Triton X-100	Eromedex	2000-B
Zetaziser NanoZS	Malvern	ZEN3500