液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

メタボロミクスは、細胞、組織、臓器、生体、または生物内の多くの低分子中間体および代謝産物の同定と定量に使用される方法論である。メタボロミクスは伝統的に水溶性代謝産物に焦点を当てています。水溶性のメタボロメは、様々なゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオミクス、および環境因子を統合する複雑な細胞ネットワークの最終生成物です。したがって、メタボロミック分析は、様々な生物内の生物学的プロセスの多くのこれらの要因の作用の結果を直接評価する。これらの生物の一つは、出芽酵母 サッカロミセスセレビシエ、完全に配列されたゲノムを持つ単細胞真核生物です。 S.cerevisiae は包括的な分子解析に適しているため、真核細胞内の多くの生物学的プロセスの根底にあるメカニズムを解剖するモデルとして使用されています。水溶性のメタボロムの堅牢で、敏感で、正確な定量的評価のための多目的な分析方法は、これらのメカニズムを解剖するための不可欠な方法論を提供するであろう。ここでは 、S.セレビシエ 細胞からの代謝活性の活性化および水溶性代謝産物抽出の最適化条件に関するプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、抽出された水溶性代謝産物の定量分析のためのタンデム質量分析(LC-MS/MS)と結合された液体クロマトグラフィーの使用を記述する。ここで説明する非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法は、汎用性と堅牢性があります。それはこれらの代謝物の異なった構造異性体および立体異性体形態を含む多様な構造、物理的、および化学的特性を有する370以上の水溶性代謝産物の識別そして定量化を可能にする。これらの代謝産物は、種々のエネルギー担体分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖類、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体を含む。LC-MS/MS法は、非標的メタボロミクスの感度が高く、0.05 pmol/μLの低濃度で水溶性代謝物の同定と定量を可能にします。この方法は、異なる条件下で培養した野生型および変異酵母細胞の水溶性メタボロメの評価に成功して使用されている。