Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Metabolomics er en metodikk som brukes for identifisering og kvantifisering av mange lavmolekylære mellomprodukter og produkter av metabolisme i en celle, vev, organ, biologisk væske eller organisme. Metabolomics fokuserer tradisjonelt på vannløselige metabolitter. Den vannløselige metabolome er det endelige produktet av et komplekst mobilnettverk som integrerer ulike genomiske, epigenomiske, transkripsjons-, proteomiske og miljømessige faktorer. Derfor vurderer den metabolomiske analysen direkte utfallet av handlingen for alle disse faktorene i en mengde biologiske prosesser innenfor ulike organismer. En av disse organismene er den spirende gjæren Saccharomyces cerevisiae, en encellulær eukaryote med det fullt sekvenserte genomet. Fordi S. cerevisiae er egnet til omfattende molekylære analyser, brukes den som modell for dissekeringsmekanismer som ligger til grunn for mange biologiske prosesser i den eukaryote cellen. En allsidig analytisk metode for den robuste, sensitive og nøyaktige kvantitative vurderingen av det vannløselige metabolomet vil gi den essensielle metodikken for dissekering av disse mekanismene. Her presenterer vi en protokoll for optimaliserte forhold for metabolsk aktivitet slukking i og vannløselig metabolittutvinning fra S. cerevisiae celler. Protokollen beskriver også bruk av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri (LC-MS/MS) for kvantitativ analyse av de ekstraherte vannløselige metabolittene. LC-MS/MS-metoden for ikke-målrettet metabolomikk som er beskrevet her, er allsidig og robust. Det muliggjør identifisering og kvantifisering av mer enn 370 vannløselige metabolitter med forskjellige strukturelle, fysiske og kjemiske egenskaper, inkludert forskjellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for disse metabolittene. Disse metabolittene inkluderer ulike energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosakkarider, mellomprodukter av glykolyse og trikarboksylsyklus mellomprodukter. LC-MS/MS-metoden for ikke-målrettet metabolomikk er følsom og tillater identifisering og kvantifisering av noen vannløselige metabolitter ved konsentrasjoner så lave som 0,05 pmol/μL. Metoden har blitt vellykket brukt til å vurdere vannløselige metabolomer av villtype og mutant gjærceller dyrket under forskjellige forhold.