저자는 이 프로토콜 개발에 있는 그들의 시간 및 지원에 대한 대학 건강 네트워크의 고급 광학 현미경 검사기 시설 (AOMF)에 있는 모든 직원에게 감사하고 싶습니다.

모든 절차는 대학 건강 네트워크 동물 관리위원회에 의해 승인되고 동물 관리에 캐나다 위원회에 의해 설정 된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
1. 스테레오전술 주입
<ol><li>나무 침구와 음식과 물에 대한 광고 리브 액세스 케이지에 쌍 하우스 성인 여성 스프라그 - Dawley 쥐 (250-280 g). 일정한 온도와 습도가 있는 일반 12h 빛/암흑 주기(06:30의 조명)에서 동물 서식지를 유지합니?...

<ol>
	<li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li><li>Nair-Roberts, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+estimates+of+dopaminergic,+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+ventral+tegmental+area,+substantia+nigra+and+retrorubral+field+in+the+rat.">Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat.</a> Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).</li><li>Golub, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurostereology+protocol+for+unbiased+quantification+of+neuronal+injury+and+neurodegeneration.">Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).</li><li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology+in+neuroscience.">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li><li>Penttinen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+deep+neural+networks+to+count+dopamine+neurons+in+substantia+nigra.">Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra.</a> European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).</li><li>Yousef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+loss+and+degeneration+in+the+progression+of+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration.">Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).</li><li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+A53T+alpha-synuclein+in+the+rat+substantia+nigra+using+a+novel+AAV1/2+vector+produces+a+rapidly+evolving+pathology+with+protein+aggregation,+dystrophic+neurite+architecture+and+nigrostriatal+degeneration+with+potential+to+model+the+pathology+of+Parkinson's+disease.">Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).</li><li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+neurodegeneration+or+endogenous+compensation+in+an+animal+model+of+Parkinson's+disease+produced+by+decreasing+doses+of+alpha-synuclein.">Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein.</a> PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).</li><li>McKinnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-onset+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+dopaminergic+neurons+caused+by+alpha-synuclein.">Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).</li><li>Henderson, M. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+alpha-synuclein+pathology+through+the+brain+connectome+is+modulated+by+selective+vulnerability+and+predicted+by+network+analysis.">Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).</li><li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV1/2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment:+a+new+mouse+model+for+Parkinson's+disease.">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).</li><li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis:+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology.">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li></ol>

PD의 전임상 모델에서 도파민 시스템의 무결성에 대한 신뢰할 수 있는 평가는 잠재적인 질병 수정 치료제의 효과를 결정하는 데 매우 중요합니다. 따라서 조직 병리학 데이터의 신뢰성과 재현성을 감소시킬 수 있는 잠재적인 혼동을 제어하고 최소화하는 것이 중요합니다. 신중한 정량적 결과는 정성적 또는 반정성 설명보다 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. 동시에, 우리는 시간과 자원의 제약...

파킨슨병(PD)은 α-시뉴클레인(α-syn)을 함유한 단백질 골재의 존재와 실산니그라 파스 콤카(SNpc)1에서도파민성 뉴런의 우대손실을 특징으로 하는 만연한 신경퇴행성 운동 장애이다. 도파민성 뉴런 수의 정량화는 PD 연구의 중요한 부분으로, 이는 nigrostriatal 시스템의 무결성의 평가를 허용하므로, 잠재적인 질병 수정 치료제의 효과를 평가하는 중요한 종점을 제공한다. 현재, 세포 수의 정량화에 대한 표준은 조직의 2차원(2D) 단면을 활용하여 3차원(3D) 구조2,3,4에서체적 특징을 추정하는 편견없는 입체 적 계수이다. 현대설계 기반 입체적 방법은 포괄적인 무작위 샘플링 절차를 채택하고 잠재적인 아티팩트및 체계적인 오류를 피하기 위해 계수 프로토콜(프로브라고 함)을 적용하여 동물 간 변형5보다약간 더 큰 차이를 안정적으로 감지할 수 있도록 합니다. 입체학은 생체 내 조직학 연구를 위한 강력한 분석 도구를 제공하지만, 시간 집약적이며 균일한 표본 준비를 가정하며, 임상 전 번역 조사에 점점 더 필요한 효율성에 영향을 미칠 수 있는 여러 단계에서 검증이 필요합니다.
디지털 과학의 최근 기술 발전은 입체 현미경없이 병리학의 보다 효율적인 평가를위한 새로운 응용 프로그램을 채택 할 수 있게, 편견 입체학의 대리로 필요성을 채우는 동안. 이러한 방법은 속도를 높이고, 사람의 실수를 줄이며, 입체 기술의 재현성을 향상6,7. HALO는 디지털 병리학에서 정량적 조직 분석을 위한 이러한 이미지 분석 플랫폼 중 하나입니다. 패턴 인식 알고리즘을 사용하여 전체 조직 섹션에 걸쳐 세포별 기초에 대한 다양한 다양한 모듈 및 보고서 형태학적 및 멀티플렉스 식 데이터를 포함한다. 세포핵 FL 모듈은 핵 또는 세포질에서 형광 마커의 면역 형광 성 양성을 측정합니다. 이를 통해 각 마커에 대해 양성 셀 수와 각 셀에 대한 강도 점수를 보고할 수 있습니다. 이 기능은 도파민성 뉴런의 정량화에는 필요하지 않지만 모듈은 개별 세포 크기와 강도 측정을 제공하도록 조정할 수 있습니다.
이 연구의 목적은 이전에 검증된 바이러스 벡터 기반 α-syn 쥐 모델인 nigral neurodegeneration8,9,10을사용하여 이 방법을 확인하는 것이다. 본 모델에서, 인간 돌연변이 A53T α-syn은 아데노 관련 바이러스 하이브리드 혈청형 1/2(AAV1/2)의 스테레오테테 주사에 의해 SNpc에서 발현되어 6주 동안 상당한 신경 변성을 초래한다. 반대로 주입되지 않은 SNpc는 일부 연구에서 주입 된 측에 대한 내부 제어 역할을 할 수 있습니다. 더 일반적으로, 동물의 대조군에서 AAV-빈 벡터(AAV-EV)를 주입하는 것은 음의 대조군으로 사용된다. 자동 이미지 분석소프트웨어(도 1)를이용하여 6주 후 주입된 SNpc에 남아 있는 도파민성 뉴런의 밀도를 추정하는 단계별 가이드를 제시한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A-Syn Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Elite</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-28180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>111-055-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAKO fluorescent mouting medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALO&#8482;</td>
			<td>Indica Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo-Clear II</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>HS202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB Peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>PAR070.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Investigator</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P21962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-quantitative determination of dopaminergic neuron density in the substantia nigra of rodent models using automated image analysis

nigra의 도파민성 뉴런의 수를 추정하는 것은 임상 전 파킨슨 병 연구의 핵심 방법입니다. 현재, 편견 입체 계수는 이러한 세포의 정량화를위한 표준이지만, 모든 프로젝트에 대해 가능하지 않을 수 있습니다 힘들고 시간이 많이 소요되는 과정남아있다. 여기서는 미리 정의된 관심 영역에서 표지된 셀의 양을 정확하게 추정할 수 있는 이미지 분석 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 쥐 두뇌에 있는 분석의 이 방법에 대한 단계별 프로토콜을 설명하고 지하 니그라에서 돌연변이 α-synuclein의 발현때문에 티로신 하이드록실라제 양성 뉴런의 현저한 감소를 확인할 수 있음을 보여줍니다. 우리는 편견없는 입체학에 의해 얻은 결과와 비교하여이 방법론을 검증했습니다. 종합하면, 이 방법은 도파민성 뉴런 수의 변화를 검출하기 위한 시간 효율적이고 정확한 프로세스를 제공하므로 세포 생존에 대한 내정간섭의 효과를 효율적으로 판단하는 데 적합합니다.

AAV 주사 후 6주 후에 수집된 뇌 조직에 위의 방법을 적용함으로써, 쥐 뇌의 SNpc에서 돌연변이 A53T α-syn(AAV-A53T)을 발현하는 AAV의 스테레오테테 주사는 빈 벡터 AAV(AAV-EV)의 주입에비해 도파미네릭 뉴런의 밀도가 현저한 감소임을 입증하였다(AAV-EV). AAV-EV로 주입된 쥐의 SNpc에서 TH 양성 뉴런/mm2의 평균 수는 276.2 ± 34.7, AAV-A53T로 주입된 쥐의 SNpc에서 41.2 ± 17(P= ...

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Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

실질적인 니그라에서 도파민성 뉴런 수의 추정은 파킨슨 병 연구에서 중요한 결과 척도입니다. 이 프로토콜은 뉴런 수를 추정하는 데 필요한 워크로드를 크게 단축합니다. 이 방법은 도파민성 뉴런 수의 변화를 검출하기 위한 시간 효율적이고 정확한 프로세스를 제공하며 세포 생존에 대한 내정간섭의 영향을 결정하는 데 적합합니다.이 방법은 전통적인 입체 적 방법에 비해 비용과 시간 이점을 유지하면서 다른 뇌 영역에서 뉴런의 정확한 수를 제공하기 위해 쉽게 적응 할 수있다. IHC 이미지를 캡처하려면 10배배율의 공초점 현미경에 결합된 소프트웨어를 사용합니다. 핀 구멍을 1.5 개의 영역 단위로 열어 총 1.5 마이크로 미터의 넓은 평면을 캡처하고 뇌의 주입 된 측면에 초점을 설정합니다.수집 탭에서 타일 스캔 이미징 옵션을 확인하고 치수를 10x 4로 설정합니다. 획득 모드 패널에서 확대/축소를 1.1로 설정하여 타일 스캔 이미지 사이의 스티치 마크를 피합니다. 프레임 크기를 1024x 1024픽셀로 설정하고 평균2픽셀로 설정하여 고품질 이미지 수집을 보장합니다.채널 패널 세트 알렉사에 하나를 트랙 488 알렉사 에 두 트랙 555. 슬라이드를 스테이지에 로드하고 TH 염색이 강한 단면을 선택합니다. 획득 패널에서 라이브를 클릭합니다.채널 패널에서 레이저 강도를 설정하고 신호를 최대화하고 배경 소음을 제한하는 수준으로 게인. 범위 표시기를 사용하여 신호가 과도하게 노출되지 않았는지 확인합니다. 여러 슬라이드로 반복합니다.획득 탭에서 위치 확인란을 선택합니다. 이미징을 시작하려면 눈조각을 사용하고 긍정적 인 TH 염색을 보여주는 첫 번째 섹션을 선택하십시오. 그런 다음 관심 지점에서 포커스를 설정하고 스테이지를 섹션의 중간선으로 이동합니다.이렇게 하면 X, Y 및 Z 축의 위치를 저장하고 전체 섹션을 캡처하는 타일 스캔을 이미지화합니다. 주입되지 않은 사이트를 포함한 다른 모든 슬라이드에 대해 이 작업을 반복합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 분리하고 자동화된 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.펜 어음 도구를 선택하여 실질적인 니그라 파스 콤팩트를 중심으로 음표기를 그려 관심 영역을 정의합니다. 분석 탭으로 이동하여 드롭다운 분석 메뉴에서 실시간 튜닝을 선택합니다. 이렇게 하면 섹션 이미지의 별도의 창이 열리므로 분석 매개 변수를 실시간으로 수정할 수 있습니다.분석 배율 섹션에서 적절한 이미지 줌을 선택합니다. 세포 검출 섹션에서 는 TH 염색에 사용되는 염료로서 핵 염료를 선택합니다. 핵 대비 임계값, 최소 핵 강도, 핵 세분화 공격성 및 핵 크기 설정을 신중하게 조정하는 동시에 시간을 조정합니다.여러 샘플로 이 프로세스를 반복합니다. 적절한 수의 이미지를 샘플링하고 실시간 튜닝이 조정되면 설정 동작 드롭다운 메뉴의 분석 설정을 저장합니다. 분석할 모든 이미지를 선택하고 분석을 클릭합니다.방금 저장된 분석 설정을 선택하고 분석 창 영역에서 별표 레이어 상자를 확인한 다음 레이어 를 확인하고 분석을 클릭합니다. 완료되면 개체 분석 데이터를 내보내는 옵션을 선택하여 모든 섹션에 대한 요약 분석 데이터를 내보냅니다. 이 데이터 세트는 독소 또는 치료에 반응하여 세포 크기의 변화를 검사하는 데 사용될 수 있었다.아데노 관련 바이러스 또는 AAV 주사 후 6 주, 쥐 뇌의 실질적인 니그라로 돌연변이 A53T 알파 시뉴클레인을 표현하는 AAV의 입체 주사는 도파민 성 뉴런의 밀도가 현저한 감소귀착되었다. AAV-A35T로 주입된 쥐의 실질적인 니그라에서 제곱된 밀리미터당 TH 양성 뉴런의 평균 수는 AAV 빈 벡터로 주입된 쥐의 평균 감소와 비교하여 현저히 감소하였다. 유사한 관찰은 편견없는 입체학을 사용하여 이루어졌다.이 프로토콜을 시도할 때 소프트웨어는 교육을 받은 만큼만 유용합니다. 따라서 단일 셀이 단일 셀로 식별되도록 시간과 주의를 기울여야 합니다. 이 소프트웨어는 알파 시뉴클레인과 같은 다른 관심사 단백질의 형광 강도를 측정하여 치료가 단백질 수준을 조절할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 조정할 수 있습니다.이 기술은 도파민저기 신경 밀도에 대한 여러 잠재적 치료법의 효과를 테스트 할 때 더 큰 효율성을 허용했습니다.