ミツバチのコロニーからの花粉の収集と同定

ミツバチから皮質花粉を採取する方法、色分類、アセトリシス、分類学的同定のための花粉の顕微鏡スライド調製のプロトコルについて説明します。さらに、花粉トラップを用いて5つの作物栽培システムから採取した皮質花粉のペレット色と分類学的多様性を提示する。

研究者はしばしばミツバチから皮質花粉を収集して分析し、花粉を採餌する植物源を特定したり、花粉を介してミツバチの農薬曝露を推定したりします。本明細書に記載されるのは、巣箱に戻るミツバチから皮質花粉を収集するための効果的な花粉捕捉方法である。この採取方法は、研究目的に使用できる大量の皮質花粉をもたらす。ミツバチは多くの植物種から花粉を集めますが、通常、各収集旅行中に1つの種を訪れます。したがって、各皮質花粉ペレットは、主に1つの植物種を表し、各花粉ペレットは色によって記述することができる。これにより、皮質花粉のサンプルを色で分類して植物源を分離することができます。研究者らは、分類学的同定のためにアセトライズされた花粉粒の形態を分析することによって、皮質花粉をさらに分類することができる。これらの方法は、受粉効率、花粉媒介者の採餌ダイナミクス、食事の質、多様性などの花粉媒介者に関連する研究で一般的に使用されています。花粉トラップを使用して皮質花粉を収集し、花粉を色で分類し、花粉粒をアセトリゼーションするための詳細な方法論が提示される。また、5つの異なる作物栽培システムにおけるミツバチから採取された皮質花粉のペレット色と分類群の頻度に関する結果も提示されている。

西洋ミツバチ(Apis mellifera L.)は、ミツバチの受粉に依存する多くの農作物の重要な花粉媒介者です¹。10年以上にわたり、ミツバチコロニーの著しい損失が²、³、⁴、⁵、⁶、⁷、^8、9と報告されている。寄生虫や病気、栄養不良や農薬など、いくつかの要因がこれらのコロニーの減少に関与している¹⁰。栄養不良は、農業の強化と採餌生息地の喪失に起因する可能性がある¹¹。ミツバチの栄養を改善し、ミツバチの保護活動を支援するために、さまざまな景観でミツバチが利用する花資源を理解することが不可欠です。花粉はミツバチのタンパク質、脂質、ビタミン、ミネラルの主な供給源であり、ミツバチのコロニーレベルの採餌嗜好を理解し、ミツバチのコロニーに対する花粉トラップの影響を評価し、ミツバチへの農薬曝露を決定するために、多くの農業および生態学的研究で使用されてきました^12,13,14。

ミツバチは花から花粉を集め、花粉をコルビキュラのペレット(後肢の脛骨花粉バスケット)に詰め、コロニーに戻って保管します。皮質花粉は、巣箱の入り口または花の上でそれらを捕獲し、それらを固定するためにそれらを短時間冷やし、次いで鉗子で後肢から花粉ペレットを除去することによって、狩猟採集者から除去することができる。個別に捕獲された狩猟採集者から皮質花粉を手作業で収集する面倒なプロセスは、かなりの量の花粉を必要とする場合、遅くて非効率的です。大量の花粉を収集するより簡単で効率的な方法は、巣箱の入り口にミツバチからの皮質花粉ペレットを閉じ込めることです。花粉トラップは、巣箱に入るときに戻ってきた花粉狩猟者の足から皮質花粉を取り除くように設計されています¹⁵。狩猟採集者は、ミツバチの労働者の体の通過を狭く許可する大きさのメッシュ穴を絞らなければなりません。

ミツバチがこれらの穴の1つを通過すると、より大きな花粉ペレットは彼女の足からこすり落とされ、収集トレイ¹⁶に落ちる。研究によると、花粉の捕獲は、より多くの花粉を集めるために狩猟採集者を刺激し、周囲の作物や植生の受粉効率を高めることが示されています^17,18,19,20。花粉収集方法論は、開花植物種の量、質、分類群を決定するための最初のステップとして、風景の中でミツバチが利用する飼料を理解するためにも使用できます。したがって、効果的な花粉捕捉方法論は、受粉とミツバチの栄養研究の両方を促進します。これらの花粉採取方法の比較を表1に例示する。花粉採餌行動は、卵および幼虫の個体群レベル^21,22と比較して、コロニーの貯蔵花粉の必要性に基づいて^{変化する。}これらの変化には収集強度の変化が含まれるため、花粉量の大きな変動は、同じ場所のコロニー間および同じ収穫システムまたは景観タイプの異なる場所の間でしばしば予想される^23,24。花粉を捕獲するコロニーと場所の数を増やすことは、この変化に対応するのに役立ちます。

花粉トラップは効率^{が異なります 25,26}.ミツバチによって収集された花粉ペレットのサイズは植物種によって異なり、コロニー内の花粉貯蔵のレベルに基づいて変化する可能性がある^27,28。これは、小さな花粉ペレットが過小評価され、大きなペレットが花粉トラップを介して収集されたサンプルで過剰に表現される可能性を提起する。成体のミツバチは体の大きさが異なり、トラップに集められた花粉の表現にも影響する可能性があります。また、主に蜜を産生する植物種もあり、一部の景観で収集された花粉を評価するだけでは検出されません。捕獲効率は、花粉トラップの種類とハイブ機器の状態によって影響を受ける、狩猟採集者のドリフトと見当識障害によっても影響を受けます。この問題は、このホワイト ペーパーで指定されている手法を採用することで軽減できます。研究者らは、コロニーレベルの採餌嗜好の結果を補うために、採餌者による花の訪問を数えるなどの追加の研究技術を検討することができる。花粉の多様性を評価するための有用な方法は、皮質花粉を色でソートすることです。ミツバチはジェネラリストの狩猟採集民ですが、花の忠実度も示し、収集旅行中に同じ場所にある同じ植物種から花粉を収集します。この採餌行動に基づいて、任意の所与の皮質花粉ペレットが、主に単一の植物種²⁷、^29、30、31によって表されると仮定する。したがって、科学者は、皮質花粉をペレット色でソートし、検出された色の総数または各色群^12,32,33,34で表される合計の割合を報告することによって、花粉の多様性を記述することができる。これは、各色群の質量またはペレット数を測定することによって達成することができる。各色群のペレット数を測定することは、異なる分類群からのペレットの重量に既知または疑わしい系統的差異がある場合に示唆される。系統的な違いは、ペレットのサイズまたはペレットを形成するときに狩猟採集者が花粉に追加する蜜の量によって引き起こされる可能性があります。

色の選別は時間効率が高く簡単なプロセスですが、異なる植物分類群が同様の花粉ペレットの色を持つ可能性があるため、一部の受粉調査研究では許容できる精度が得られない可能性があります^35,36。さらに、花粉ペレットを分離できる別個の色グループの数には物流上の制限があります。したがって、個々の植物分類群花粉をそれ自身の別個のペレット色群に分離することは、受粉研究において常に可能ではないかもしれない。光顕微鏡による花粉粒の形態学的特徴付けは、しばしば、同じ色群のペレット中の2つ以上の分類群の花粉を区別することによって、ペレットの色分離を補完する。特定の花粉ペレットの色群で複数の分類群の花粉粒を見つけるのが一般的ですが、ミツバチによって収集された個々の花粉ペレットは、一般的に1つの優勢な分類群を含み、おそらく他の分類群と少量です。したがって、ミツバチの皮質花粉ペレットにおける分類学的忠実度を仮定することが一般的である。マルハナバチのような花の忠実度行動を示さない他の花粉媒介者からの花粉ペレットは、しばしば多くの植物種を含み、優勢な分類群を有しないかもしれない。ポリフローラル花粉ペレット中の分類群比率の定量的推定が望まれる場合、適切な分析のためには、アセト分解を含む微視的方法がさらに必要である。

アセトライズされた花粉粒の形態学的特徴を評価することは、分類学的同定のための最も一般的な方法^である16。アセト分解手順は、花粉粒の原形質を除去して、光学顕微鏡下で観察することができる診断特性を露出させる^37,38。この方法を使用して、研究者は異なる分類群、特定の作物栽培システムに見られる分類群の頻度、およびペレット色の優勢な分類群を報告することができる^33,36。アセト分解は、花粉の形態を明らかにするための最良の分析技術である²⁸。しかし、多くのバラ科の種類など、いくつかのアセトライズされた花粉粒は、アセト分解および光学顕微鏡法のみでは属または種レベルに同定できない。研究者らは、走査型電子顕微鏡またはメタバーコード法を、属または種レベルの同定を達成するための代替方法と見なしています。しかし、これらの代替方法は定性的な分類群の同定のみを提供し、多花花粉ペレット中の異なる花粉粒分類群の割合を推定することができない^36,39。さらに、これらの方法では、費用と必要な専門知識がかなり高くなります。これらの同定方法の比較を表1に示します。

表1:時間、費用、解像度、および専門知識に基づく花粉の収集と同定のさまざまな方法の比較。 視覚的メソッド (カラー ソートのみ) は、検出された色の総数または各カラー グループによって表される合計の割合を、花粉の発生源を決定するためのメトリックとして報告しますが、分類群の識別は提供しません。

花粉の捕獲と選別、花粉粒の分解に関する情報は多様であり、多くの場合、複数の情報源にまたがって広がっており、さまざまな分野の研究者によって異なります。この論文では、研究者と養蜂家の両方が大量の皮質花粉を効果的に収集するために使用できるさまざまな種類の花粉トラップに関する詳細な洞察を提供します。また、植物分類群の同定のために、アセト分解、染色、スライドマウントによる花粉サンプルの調製プロトコルも提供されています。ここで詳述する方法論は包括的であり、ミツバチが特定の景観、特に作物栽培システムにおいて餌を採餌する優勢な植物種を特定するためのユニークなリソースとして役立ちます。以前の研究からのこれらの方法に基づく知見が提示され、5つの収穫システムにおけるミツバチによって収集された皮質花粉からの花粉ペレットの色および植物分類群の多様性を文書化している¹⁴。

1. 花粉トラップを用いたミツバチのコロニーからの皮質花粉の採取

1. 目的の養蜂場の場所から花粉をトラップするタイミングを決定します。
   注:理想的な気候条件には、完全な日光曝露、低風速、低湿度、花粉収集に必要な期間中の予測降水量がないことが含まれます。
2. 養蜂場の場所内に花粉を閉じ込めるための最適なミツバチのコロニーを選択してください。
   1. コロニーの入り口に戻る狩猟採集者を2分間数えてコロニーの強さを評価します。帰還した狩猟採集民の総数が最も多いコロニーを選択します。
   2. 木製の陶器で、良好な状態の、できれば余分な入り口やゆがんだ蓋のない巣箱を選択してください。代替入り口の少ないコロニーを使用すると、トラップの入り口に向きを変えた狩猟採集民が戻ってくる可能性が高まります。
   3. 可能な限り、南向きのハイブの入り口を選択してください。巣箱がパレット化されている場合は、特定のパレットで同じ方向を向いているすべてのコロニーに花粉トラップを設置して、狩猟採集者が近隣の巣箱の入り口に漂流するのを防ぎます。
   4. 必要に応じて、幼虫の存在についてフレームを検査することによってコロニーのひなの巣を評価する。比較的大量の幼虫を有するコロニーを選択する。
3. 選択したミツバチのコロニーに花粉トラップを設置します。
   メモ:インストールは花粉トラップの種類によって異なります。タイプには、a)フロントマウント、b)ボトムマウント、c)トップマウント、またはd)オーガーホールエントランスマウントが含まれます。詳細については、ディスカッションのセクションを参照してください。
   1. 前面取り付けトラップの場合は、ステープル、ネジ、テープでトラップを入り口の前に取り付けるか、ハイブに巻き付けられたバンジーコードに接続します。ボトムマウントトラップの場合は、トラップを一番下のハイブボックスの下に置き、トラップ入り口を元の入り口の近くに固定します。オーガーホールマウントトラップの場合は、ステープル、ネジ、およびテープを使用して、ハイブボックスのオーガー穴の直前にトラップを取り付けます。トップマウントトラップの場合は、トラップを最上部のハイブボックスの上と蓋の下に置きます。
4. ラテックスやポリウレタンフォームなどの非接着で成形可能な材料、またはオーガー穴用の#8ハードウェアクロス(2.7mmアパーチャ)を使用して、コロニーへの他のすべての可能な入り口をシールします。小さな亀裂には粘着テープを使用してください。
5. フロントマウントトラップを使用する場合は、露による湿気による損傷を避けるために、収集バスケットと草の間にゴムマットなどのバリアを配置してください。
6. 花粉トラップの捕集機構は、設置後24時間、その日の採餌飛行が始まる前(深夜/早朝)に関与してください。
   メモ: この手順は理想的ですが、必須ではありません。特定の期間を通じて同じコロニーに花粉を閉じ込める場合は、隔週で花粉トラップを作動させます。
7. 収集トレイから皮質花粉を回収し、ビニール袋または遠沈管に入れ、氷の入ったクーラーに保管してください。
   1. 花粉種の多様性と豊富さを評価するために、例えば、景観レベルの栄養研究、2つまたは3つの72時間間隔で花粉を収集する⁴⁰。
   2. 残留農薬分析のために、24時間から96時間間隔で花粉を収集し、処理のために最低3gを⁴¹で集める。
8. ミツバチの部分やその他の巣箱の破片を取り除いて花粉をきれいにします。
   メモ:花粉サンプルを取り扱うときは使い捨て手袋を使用し、サンプル間で使い捨て手袋を交換してください。別々のツールを使用して、各トラップに収集された花粉から破片を取り除きます。すすぎ、乾燥してから、閉じ込められた花粉の別のバッチにツールを使用してください。
9. 花粉が花粉源の同定、量評価、または残留農薬分析を目的としている場合、花粉を-20°C以下に保存して組成の完全性を維持する^41,42.
10. 巣箱からトラップを取り除いた後、すべての機器を5%漂白剤溶液で滅菌し、すすぎ、乾燥させてから次の使用にしてください。

2.下流の花粉源の識別と量評価のための花粉ペレットカラーソーティング

1. 少なくとも20gの花粉サンプルがあることを確認してください。花粉サンプルをそのバッグまたは別の適切なサイズの容器に完全に混合して、そこに含まれるすべてのペレットの均質な混合物を得る。次のステップで意図しない偏りを避けるため、サンプルバッグからサブサンプルを取り出す前に、サンプルの色組成を視界から隠します。
2. スクーパーまたは大きなスプーンを使用して、全体の代表的なサブサンプルとして10gの花粉をすくい取ります。ディスプレイが10 gと表示されるまで、スクーパーからペレットを天秤にゆっくりと注ぎます。最初のスクープが十分な大きさでない場合は、同じ方法でサンプルから別のスクープを取得します。
   注: これらの指定された重量要件 (20 g および 10 g) は、単なる例として役立ちます。研究者は、特定のニーズに応じて、各ステップで使用される花粉の量を調整する必要があります。
3. 10 gのサブサンプルからすべてのミツバチの部分と他の破片を取り除きます。次に、必要に応じて、元のサンプルから花粉をもう少し加えて、サブサンプルの総重量10gを達成します。
4. 10 g のサブサンプルの各花粉ペレットをカラーグループに分類します。花粉の色と質感の両方を使用して、カラーグループを区別します。
   メモ: グループ内で多少のばらつきが予想されますが、並べ替え中に Pantone カラーガイドを使用すると、一貫性が向上します。
5. 下流工程で各色群を少なくとも0.25g確保するには、少なくとも0.25gの色群を形成するのに十分な量ではないペレットをその他のグループに入れます。パントンカラーガイドを使用して、個々のカラーグループに名前を付けます。その他のグループにはラベルを付け ます。
6. 別々の計量紙で各カラーグループの計量、および/または各カラーグループのペレットの数を数えます。カラーグループ名と重みまたはカウントをデータシートに記録します。
   注:各カラーグループのペレットの数を計量するかカウントするかの選択は、研究者の関心のある指標とプロジェクトの目標によって異なります。
7. 耐溶剤性ペンと粘着性紙管ラベルを使用して、各色グループの微量遠心管ラベルを作成します。ラベルに現在の日付、サンプル識別子、サンプル収集日、およびカラーグループ番号を含めます。ラベルを清潔で乾燥した2 mLの微量遠心チューブに塗布します。
8. 各色群の花粉ペレット0.25g(±0.05g)を秤量し、この量を適切なラベルの付いた微量遠心チューブに入れます。
   メモ:特定のカラーグループの花粉の色や質感にわずかなばらつきがある場合は、各チューブ内にペレットの代表的なサンプルがあることを確認してください。それに続く試薬容量およびインキュベーションおよび遠心分離時間は、0.25gの花粉に対して適切である。そのため、この量の花粉をアセト分解に使用する微量遠心管に使用してください。このプロトコルは、光学顕微鏡による下流の植物源同定のために、十分に染色された花粉を提供するべきである。アセト分解で異なる量の花粉を使用する場合は、試薬量と処理時間の詳細をそれに応じて調整する必要があります。
9. 各カラーグループの残りの花粉を、カラーグループ名でラベル付けされた個々のビニール袋(カラーごとに1袋)に入れます。これらの袋を適切なオリジナルサンプルの他の部分とともに-20°Cの保管に保管してください。
10. チューブ内の花粉を清潔な木製のつまようじで10〜15秒間徹底的に混ぜます。

3. アセト分解の準備

1. アセト分解の一部を初めて開始する前に、指定機関の環境安全衛生(EHS)部門に連絡して、アセト分解関連の試薬および廃棄物の処理方法について指示を受けてください。
2. 以下の試薬のストック溶液を入手し、化学貯蔵のためのEHSガイドラインに従ってヒュームフードに入れる:95%エタノール;蒸留水;氷酢酸、無水;濃硫酸;グリセリン;そして透明なマニキュア。
3. 以下の試薬のストック溶液を調製し、化学的貯蔵のためのEHSガイドラインに従ってヒュームフードに入れる:飽和重曹(蒸留水中の8%w / v溶液)。サフラニンO(50%エタノール中の1%w / v溶液)。

4. アセト分解

1. 氷酢酸洗浄の前アセト分解手順を実行する。ヒュームフード内で、白衣、眼の保護具、ニトリル手袋を使用して、次の手順を実行します。
   1. ヒートブロックを80°Cにしてください。
      メモ:飽和炭酸水素ナトリウムのスクイーズボトルに簡単にアクセスできることを確認してください。これは、ヒュームフード内の酸こぼれが発生した場合に中和するために使用できます。
   2. 1つのガラスビーカーを酸廃棄物用、1つをエタノール廃棄物用、および1つをアセト分解混合物用にラベル付けします。
   3. 以前に調製したストック溶液を使用して、標識された適切なサイズのガラスビーカーに以下の試薬の作業アリコートを作成する:〜23.0mLの氷酢酸;〜33.0mLの蒸留水;〜23.0mLの95%エタノール;約25.0 mLの炭酸水素ナトリウム(酸汚染固形廃棄物用)。
      注:これらは、合計10のカラーグループサンプル(10本の微量遠心チューブ)で以下のアセト分解手順を完了するために必要な容量です。
   4. 0.25gの色群花粉を含む各微量遠心管に500μLの氷酢酸をゆっくりと加える。チューブを目視で検査しながら、きれいなつまようじで花粉を10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後に使用済みのつまようじを炭酸水素ナトリウム廃ビーカーに入れます。チューブごとにこのプロセスを繰り返します。
      メモ: チューブごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。
   5. サンプルを1,100 × gで3分間遠心分離 します。チューブの上清を酸廃棄物ビーカーにデカントする。次に、チューブの開いた口に清潔なペーパータオルで柔らかく短時間触れ、チューブの縁の周りの残留氷酢酸を除去します。
      注:上清をデカントするときに花粉ペレットを失わないように注意してください。
2. アセト分解手順を実行します。
   メモ: ヒュームフード内で、白衣、眼の保護具、ブチルビニール手袋を使用して、次の手順を実行します。
   1. 最初に10.8mLの氷酢酸(作業アリコートから)をビーカー標識アセト分解混合物に加えることによって 、アセト分解混合物(9:1氷酢酸:硫酸)を調製する。次いで、1250 μLの濾過ピペットチップを取り付けた1000 μLのピペットを用いて、氷酢酸を含むアセト分解混合ビーカーに原液から濃硫酸1200 μL(1.2 mL)をゆっくりと加える。使用済みのピペットチップを炭酸水素ナトリウムのビーカーに捨てます。
      注:アセト分解混合物ビーカーは、触ると暖かくなり、混合物が黄色に変わることがあります。混合物が暗い色に変わる原因となる2つの可能性があります:(a)試薬が有効期限を過ぎている可能性がある、または(b)あまりにも多くの硫酸が添加されている可能性があります。いずれにせよ、混合物が暗くなった場合は、酸廃ビーカーに捨て、新鮮なアセト分解混合物を調製する。
   2. アセト分解混合物をガラス棒または木製の攪拌棒で静かに攪拌し、均質化されていることを確認します。使用済みのロッド/スティックを炭酸水素ナトリウムのビーカーに入れます。
   3. 1000 μLのピペットと1250 μLのろ過ピペットチップを使用して、ビーカーから1000 μLのアセト分解混合物を各チューブにゆっくりと加えます。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後は使用済みのつまようじを炭酸水素ナトリウム廃ビーカーに入れます。
      メモ: サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。
   4. サンプルを予熱(80°C)ヒートブロックの上に置きます。チューブを5分間インキュベートし、インキュベーションの途中で清潔なつまようじで各チューブを十分に攪拌します。使用後、使用済みの各つまようじを炭酸水素ナトリウムのビーカーに入れます。
      注:サンプルにつまようじを残さないでください。酸はそれらを溶解します。
3. アセト分解後の氷酢酸洗浄手順を実行する。
   メモ: ヒュームフードに、白衣、眼の保護具、ブチルビニール手袋を装着して、次の手順を実行します。
   1. 各チューブに500μLの氷酢酸をゆっくりと加える。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後は使用済みのつまようじを炭酸水素ナトリウムのビーカーに入れます。
      メモ: サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。
   2. サンプルを1,100 × gで3分間遠心分離 します。各チューブの上清を酸廃棄物ビーカーにデカントする。次に、チューブの開いた口に清潔なペーパータオルで柔らかく短時間触れ、チューブの縁の周りの残留酸を除去します。
   3. ブチルビニール手袋を流水で少なくとも30秒間十分にすすぎ、取り外して乾かします。
      メモ: ブチルビニール手袋の再利用に関する製造元のガイドラインに従ってください。
4. 各サンプルに対して3回の水すすぎを実行します。ヒュームフード内で、白衣、眼の保護具、ニトリル手袋を使用して、次の手順を実行します。
   1. 蒸留水ビーカーから1000 μLの蒸留水を各チューブに加えます。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後は重曹廃ビーカーに爪楊枝を入れます。
      メモ: サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。
   2. サンプルを1,100 × gで3分間遠心分離 します。チューブから上清を炭酸水素ナトリウムのビーカーにデカントする。次に、チューブの開いた口を清潔なペーパータオルでそっと触れ、チューブの縁の周りの残留水を取り除きます。
   3. 手順4.4.1-4.4.2をさらに2回繰り返して、合計3回の水すすぎを行います。
5. 各試料についてエタノールリンスを行う。
   メモ:ヒュームフード内で、白衣、眼の保護具、ニトリル手袋を着用して、次の手順を実行します。
   1. 1000 μLのピペットと1250 μLのろ過ピペットチップを使用して、エタノールビーカーから1000 μLの95%エタノールを各チューブに加えます。ピペットチップを無害な廃棄物に捨ててください。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。
      注:使用後は、つまようじを炭酸水素ナトリウム廃ビーカーに入れてください。サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。
   2. サンプルを1,100 × gで3分間遠心分離 します。チューブの上澄み液をエタノール廃ビーカーにデカントし、チューブの開いた口に清潔なペーパータオルでそっと触れて、チューブから残留エタノールを除去した。
6. ラボコート、眼の保護具、ニトリル手袋を着用してサンプルを染色します。サフラニンO染色原液を緩やかな反転を用いて混合する。
   1. 使い捨てのプラスチック転写ピペットを使用して、各チューブに5〜10滴のサフラニンO染色剤を加える。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。つまようじをチューブに入れたままにします。
   2. 1000 μLのピペットと1250 μLのろ過ピペットチップを使用して、エタノールビーカーから1000 μLの95%エタノールを各チューブに加えます。ピペットチップを無害な廃棄物に捨ててください。チューブを目視で検査しながら、つまようじで10〜15秒間攪拌し、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後は使用済みのつまようじを無害廃棄物に入れます。
   3. 各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。1,100 × gで3分間遠心分離する。上清をエタノール廃ビーカーにデカントする。
      注:今回はペーパータオルでチューブの口に触れないでください。
   4. プラスチック製の使い捨て転写ピペットを使用して、各チューブにグリセリンを10〜15滴加える。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじでチューブの内容物を10〜15秒間攪拌し、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。
      メモ:使用後は、使用済みのつまようじを無害廃棄物に入れてください。サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。すべてのチューブラベルが読みやすいことを確認します。
7. チューブをヒュームフードに開いたままにして、周囲室温で少なくとも2時間エタノールを蒸発させます。サンプルのエタノール臭を確認する:検出可能な場合は、サンプルの準備ができておらず、エタノール臭が消散するまで乾燥させる必要があります。
8. すべての材料をきれいにし、廃棄物を処分する。遠心分離機とヒートブロックの両方のスイッチを切ります。固形廃棄物、液体廃棄物は、指定機関の環境安全衛生ガイドラインに従って処分する。
9. 花粉識別のための顕微鏡スライドを準備します;読みやすいラベルを付けます。取り付ける各カラーグループ/サンプルに対して、清潔なガラス顕微鏡スライドに適切なラベルを付けます。チューブを目視で検査しながら、サンプルを清潔なつまようじで10〜15秒間攪拌し、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。
   メモ: スライドの準備は、ラボベンチで行うことができます。爪楊枝は無害な廃棄物に捨ててください。サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。
   1. 清潔な使い捨てプラスチック転写ピペットを使用して、チューブから花粉残渣を1滴取り除き、ラベルの付いた顕微鏡スライドの中央に置きます。滴がわずかに広がるのを待ちます。スライド上のドロップの上に清潔なカバースリップを置きます。
   2. スライドが乾いたら、カバースリップを透明なマニキュアでスライドに密封します。カバースリップの各角にポリッシュを少量置き、カバースリップの周囲にスライドと接する周囲にポリッシュの境界線をペイントします。マニキュアが完全に乾くのを待ち、カバースリップの周囲に2番目のポリッシュコートをペイントします。

以前の研究では、ミツバチがアーモンド、チェリー、ハイブッシュブルーベリー、ハイブリッドニンジン、メドウフォーム¹⁴の農作物で収集した花粉の多様性の評価が報告されました。記載された方法を用いて、皮質花粉を収集し、色別にソートし、各ペレット色群の植物源を同定し、花粉の多様性を評価した。ボトムマウント花粉トラップは、作物ごとに複数の場所のコロニーに設置されました(図1A)。各部位から採取した花粉の量は、色選別法およびアセト分解分析法のサンプル重量要件を満たすのに十分であった。すべての花粉収集サンプルには、複数の区別可能なカラーグループがありました(図2および図3)。いくつかのサンプルでは、花粉の色群はわずか4〜5個のペレットしか含んでいませんでした。しかし、ほとんどの群はそれより有意に多くを有し、したがって、アセト分解のための独自の標識色群として役立った(図4および図5)。アセト分解後(図6)、明視野光学顕微鏡を用いて、各研究部位の周囲から採取したバウチャー標本の形態学的特徴を確認することにより、各色群を可能な限り低い分類学的ランクまで効果的に同定した(図7)。

図1:皮質花粉を収集するためにミツバチのコロニーに取り付けられた花粉トラップ。 (A)ハイブボトムボードの上と最も低いハイブボックスの真上に配置されたボトムマウントトラップ。他の花粉トラップスタイルには、(B)フロントマウントと(C)オーガーホールエントランスマウントトラップがあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:花粉トラップのトラップ機構と回収トレイ。 戻ってきた花粉の狩猟採集者は、巣箱に到達する前にメッシュトラップメカニズムを圧迫する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:花粉トラップの収集トレイ 皮質花粉は、花粉トラップによって戻ってきた花粉狩猟者の足を削り取られ、収集トレイに落ちます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:皮質花粉のサンプルをカラーグループに分類する。 皮質花粉は、カラーグループに分類した後に乾燥させて秤量し、収集された異なるカラーペレットの割合を報告することができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:パントンカラーガイドを使用して色別にソートされた花粉ペレットの4つのグループ。 カラー グループは、(A) グレー、パントン 5855C、(B) ブラウン、パントン 7557C、(C) イエロー、パントン 458C、および (D) ライト ブラウン、パントン 3547C とラベル付けされています 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:ヒュームフード内のアセト分解装置のセットアップ ヒートブロック、試薬、溶剤廃棄物および酸廃棄物容器、ラベル付きビーカー、ピペット、ピペットチップ、攪拌スティック、およびヒュームフードの内側に位置する微量遠心チューブ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:染色され、アセトリゼーションされた花粉粒の顕微鏡写真。 アセトリゼドマスタード(アブラナ科)花粉粒の多くの側面を倍率40倍で。スケール バー = 50.398 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

アーモンドの収穫地から採取された花粉は、他の作物から採取した花粉よりも花粉の多様性が比較的低く、1カ所あたり平均3.0±0.5個のペレット色と3.2±1.2個の植物分類群であった(表2)¹⁴。残りの4つの作物栽培システムは、花粉の多様性レベルが高く、ハイブリッドニンジンでは1サイトあたり平均6.0±2.0ペレット色と8.0±1.5植物分類群、ハイブッシュブルーベリーでは1サイトあたり8.8±1.4ペレット色と13.5±2.0植物分類群、ハイブリッドニンジンでは1サイトあたり7.0±1.0ペレット色と11.0±0.0植物分類群、メドウフォームでは1サイトあたり10.0±0.0ペレット色と13.0±1.5植物分類群^でした。

表2:5つの作物栽培システムにおけるミツバチから採取された皮質花粉の多様性。 多様性の指標には、ペレットの色の平均数(±SE)、植物分類群の平均数(SE±)、および識別された総分類群が含まれます。この表は¹⁴ から変更されました。省略形: SE = 標準エラー。

異なる花粉トラップスタイルには、独自の利点と結果があります。一般的に使用される4つのトラップスタイル、(1)フロントマウント、(2)ボトムマウント、(3)オーガーホール、および(4)トップマウント花粉トラップの利点と制限については、以下で説明します。フロントマウントトラップは、最も汎用性の高いスタイルです(図1B)。インストールは迅速かつ簡単です。ハイブボックスを持ち上げることなく行うことができ、これらのトラップはラングストローススタイルのハイブ機器に収まります。収集トレイはコロニーの前に座っているので、コロニーから最小限の破片を収集します。しかし、収集トレイはまた、外部要素にさらされます - 畑の灌漑、雨や湿気の多い天候からの水分、または露が収集トレイを通して花粉と接触する可能性があり、ペレットが飽和しすぎて分離できなくなると花粉が使用できなくなる可能性があります。花粉飽和のリスクは、雨や高湿度の予測イベント中にトラップを回避することによって低減することができます。トラップの下にゴムマットを置き、花粉トラップの上に余分な被覆材(例えば、屋根ふきフェルト)を置くことで、収集トレイを天候から保護することもできます。

ボトムマウントトラップを使用して、この論文のデータ用の花粉を収集しました(図1A)。彼らはコロニーのひなの巣の下に置かなければならないので、彼らはインストールするのにそれほど便利ではありません。設置には時間がかかり、ミツバチの部分やワックスの小さな破片など、コロニーからトラップに大量の破片が落ちます。ほとんどの製造ボトムマウントトラップの収集トレイの床は細かいメッシュでできており、収集された花粉を湿気から保護するための適切な換気が可能です。オージェ穴花粉トラップは、主に巣箱の底板によって作られた入り口ではなく、巣箱の入り口としてオーガー穴を使用する場合、狩猟採集者の見当識障害を最小限に抑えるのに役立ちます(図1C)。オーガーホール花粉トラップ用の収集トレイは非常に小さいため、収集トレイのオーバーフローを避けるために頻繁に空にする必要があります。ハイブの上に配置されているため、トップマウントの花粉トラップは、取り付けと取り外しが最も簡単なトラップスタイルであり、収集された花粉サンプルにはハイブの破片がありません。ただし、このトラップスタイルは、蓋、内側カバー、および上部ハイブボックスが適切に密閉されていない場合、収集トレイが湿気にさらされるため、損傷したハイブ機器に非常に敏感です。

本明細書に記載されるプロトコールは、大規模な成虫および幼虫集団を有するコロニーを選択することを要求する(ステップ1.2)。この選択方法は、これらのコロニーから非常に大量の捕捉された花粉を産生することを意図している。かなりの採餌個体群を持つコロニーは、トラップの設置時に入り口で激しい渋滞を経験することがあります。大きなハイブの入り口を選択すると、混雑が緩和されます。大規模な採餌集団はまた、収集トレイの境界を超えることができる非常に大量の花粉を収集する可能性がある。ほとんどのボトムマウントまたはトップマウントトラップスタイルに見られるように、大量の収集トレイを使用し、大量のトラップされた花粉を収容するために空のトレイを頻繁に使用してください。目的の研究目的が養蜂場のコロニーによって収集された花粉の量を評価することである場合、選択のために成虫および幼虫集団を最適化するのではなく、代表的なコロニーを選択する。すべてのスタイルの花粉トラップがハイブの入り口をブロックし、元の入り口¹⁶とは空間的に異なる新しい入り口を作成します。花粉トラップは、狩猟採集者が設置時に花粉トラップの新しい入り口に向きを変えることができない場合、一般的に花粉を集めることができません。これらの狩猟採集民は容易に近隣の巣箱に漂流し、花粉トラップで別の巣箱に入ると他の花粉収集サンプルを交差汚染する可能性があります。したがって、狩猟採集民は、設置後にトラップ機構を切り離したままにすることによって、新しい入り口に順応するために少なくとも24時間与えられるべきである。追加のハイブ入り口がほとんどまたはまったくないコロニーを選択すると、新しい花粉トラップ入り口に向かう際の混乱も軽減されます。

追加の巣箱の入り口(穴やゆがんだふたなど)は密閉する必要がありますが、捕獲者が近隣の巣箱に漂流するリスクは、トラップ設置の開始時にこれらの入り口が存在すると増加します。花粉トラップがパレット化された巣箱のクラスター内の単一の巣箱にのみ設置されている場合、狩猟採集者は他の巣箱の入り口に容易に漂流します。パレット上の同じ方向を向いているすべての巣箱にトラップが取り付けられている場合、狩猟採集者はドリフトする可能性が低くなります。トップマウントの花粉トラップは、花粉トラップの入り口とハイブの元の入り口との間にかなりの距離があるため、ミツバチのドリフトのリスクが高くなる可能性があります。本研究では、各実験場所の複数のミツバチコロニーに花粉トラップを設置し、各ミツバチコロニー間の花粉量と分類群組成のばらつきを考慮した。したがって、花粉収集は植物種の種類と総収集量^12,13に基づいてコロニー間で大きく異なる可能性があるため、花粉トラップを複数のコロニーに設置して、景観からの堅牢な花粉収集を達成する必要があります。各花粉サンプルは7日間の収集期間を有していた。今後の研究では、2~3回連続した72時間間隔で花粉を集めることで、花粉飼料推定の精度が高まる⁴⁰。

花粉収集には時間的変動が大きいため、対象作物採取システムの早期、ピーク、晩咲きの時期に花粉収集プロセスを繰り返すことで、花粉推定精度を高めることができた^24,27,39.花粉は、養蜂場の場所^14,27,33,43の間で量と植物種の種類の変動が予想されるため、同じ収穫システムまたは景観タイプにもかかわらず、複数の場所から収集する必要があります。長期的な花粉捕捉は、ミツバチのコロニーに有害であり得る。潜在的な影響には、繁殖の減少、幼虫の成長期間の短縮、および巣箱内の卵および若い幼虫の共食いが含まれる19,44,45,46。成長期全体など、花粉の捕獲期間が長くなると、コロニーでのひなの飼育への有害な影響が悪化する可能性があります。花粉捕捉はまた、蜂蜜生産の減少および貯蔵された蜂蜜¹³の水分レベルの増加を引き起こし得る。景観や作物栽培システムを継続的に監視しているときに、養蜂場のコロニー間で花粉トラップを回転させることで、花粉トラップに使用されるコロニーへの害を軽減することができます。隔週で花粉トラップを作動させることで、一定期間を通じて同じコロニーに花粉を捕獲した場合、有害な影響、特に蜂蜜生産の損失が軽減されます¹³。

また、花粉トラップは、強いコロニー上に配置されることが好ましい。時折、花粉トラップは意図せずに関与することがあります。これは、花粉トラップの収集が望ましくない場合に花粉トラップ機構をロックすることによって回避することができる。花粉トラップは、ミツバチの狩猟採集者からすべての皮質花粉を除去するわけではありません。トラップ効率は、トラップの種類、花粉ペレットのサイズ、ミツバチの体のサイズ、時間帯、気象条件によって異なります。したがって、皮質花粉収集は、異なる植物種および収集期間^25,26に対して花粉トラップを使用する場合、一貫していない。ユーカリ属やタマリックス属などの植物由来のより小さな花粉ペレットは、花粉トラップ²⁷に捕獲される可能性は低い。特に、この研究ではハイブッシュブルーベリー採取サイトからハイブッシュブルーベリー(Vaccinium corymbosum L.)花粉は見つかっておらず、これはハイブッシュブルーベリー花粉ペレットが花粉トラップ収集には小さすぎるという以前の証拠を支持している⁴⁷。対照的に、タンポポ(Taraxacum officinale F.H. Wigg)から供給された花粉は、この研究のすべての作物栽培システムで見つかった。いくつかの植物種の花粉ペレットはまた、Taraxacum spp.のような他のものよりもはるかに大きくなることがあり、花粉トラップ²⁷からの花粉収集の分析において過剰に表現される可能性がある。個々の花粉狩猟者を捕獲し、皮質花粉を手動で除去すると、花粉源評価の精度は向上しますが、花粉トラップを使用する場合と比較して非常に時間とリソースがかかります(表1)。花粉ペレットをカラーグループに分類することは、時間がかかりますが、比較的簡単です。特定の研究目標または目的がない限り、花粉ペレットの量は、カラーグループに分類するために(任意のサンプルに対して)10g以下に制限されるべきである。この量を超える量を含むサンプル全体をソートすると、分析の完了に必要な時間が大幅に長くなります。しかし、花粉サンプルは、色分類用のサブサンプルを採取する前に、非常によく混合されていることが重要です。元のサンプルを混合しないと、全体を表すものではないサブサンプルが発生する可能性があるため、避ける必要があります。

元のサンプル容器に花粉ペレットの徹底的な混合を可能にするのに十分な空きスペースがない場合は、大きなサンプルであっても、サンプル全体を大きなビニール袋または小さな紙袋に入れるだけで十分です。硬質プラスチック、蓋付き容器も機能します。サンプルの混合は、花粉ペレットが押しつぶされたり、破壊されたりしないように、穏やかに行う必要があります。意図しないバイアスは、例えば全体からサブサンプルを除去するときに、「かなり紫色のペレット」をすくい取るように無意識のうちに説得する可能性があります。したがって、サンプルの色組成は、サブサンプルをすくい取るときにビューから隠す必要があります。このようにして、全体を真に代表するサブサンプルを取得する可能性が高くなります。しかし、このサブサンプリング方法では、サンプル中の存在量が少ない花粉ペレットを選択できない可能性があります。したがって、サンプルに含まれる個々の植物分類群を特定することが研究目標である場合、サブサンプルの収集は適切ではありません。サンプル全体を分析する必要があります。したがって、ペレットはガラスのペトリ皿で分類する必要があります。ソートが完了したら、パントンカラーガイドの適切なページを皿の下に配置して、ガイドとソートされた花粉のカラーマッチングを容易にすることができます。この例を 図 5 に示します。

受粉のために作物に入れられたミツバチのコロニーから花粉を捕獲するときは、9つの個々の色とサンプル中の少数色で構成される1つの「雑多な」色グループの合計10色群以下を使用する必要があります。サンプルを分割できるカラーグループの最大数に合理的な制限を設けることで、ペレットをますます増え続ける非常に特定のグループに無限に分離することによって研究者が行き詰まるのを防ぎます。非常に多様な植物種の品揃えから採餌されている可能性のあるコロニーから捕獲する場合、より多くのカラーグループが必要になる可能性があり、プロトコルはその要件を反映するように最適化する必要があります。本研究は、作物を受粉するミツバチのコロニーから採取された花粉サンプルに焦点を当て、複数の分類群が、以前の研究と同様に、カラーグループで一般的に見出された^29,30,31。

アセト分解は、花粉粒の表面から脂質、タンパク質、および有機破片を溶解し、エキシンの際立った特徴を明らかにするので、粒子をより容易に染色して同定することができる。これは、多くの種類の花粉研究で使用されている古くて一般的な方法論^です37。一般的な手順は標準化されています。それらはプロトコルによってほとんど変わりません。しかし、遠心分離の速度と時間、インキュベーションの温度と期間、花粉量主導の試薬量、さらには上清除去方法(デカント対ピペッティング)の詳細は、研究目標と、ある程度までは遭遇する可能性のある花粉の種類に応じて実験的に最適化する必要があります⁴⁸。実際、アセト分解は、マルバセア科やラン科などのいくつかの分類群から花粉の重要な診断特性を除去することができる³⁸。したがって、すべての花粉が標準的なアセト分解法に順応できるわけではありません。上記のように、これらの方法は、作物受粉ミツバチによって収集された花粉の支配的な植物分類群源を特定する目的で、本研究において最適化された。花粉粒の正確な定量化が研究の一部である場合に考慮すべき詳細は、この論文では取り上げられていない。

溶剤と酸を使用するには、慎重な計画、適切な個人用保護具(PPE)、および責任ある廃棄物処理が必要です(図6)。研究者は、アセトリシスの任意の部分を開始する前に、試薬を保管し、廃棄物を処分する正しい方法を決定することが重要です。この研究室では、ブチル手袋は、硫酸や氷酢酸を含むプロセスのどの部分でも使用され、両酸の分解および透過定格はニトリル手袋よりもはるかに優れていますが、器用さを損なうことはありません⁴⁹。適切な手袋やその他のPPE⁴⁹に関する推奨事項については、それぞれの機関の安全ガイドラインを参照することが賢明です。アセト分解工程の前に氷酢酸を添加すると、サンプル中の残留水分を除去し、重要なアセト分解反応の準備に役立ちます。アセト分解工程における氷酢酸 - 硫酸混合物は水と激しく反応する可能性があるため、すべてのガラス製品および供給品が完全に乾燥していること、およびアセト分解前にすべての水分がサンプルから除去されることが重要です。アセト分解後の氷酢酸の添加は、アセト分解混合物を希釈し、中和する。

エタノールおよび氷酢酸は、特に、これらの試薬が耐溶剤性ペンを用いてもチューブの外側に滴り落ちる場合、微量遠心チューブラベルのインクを溶解することができる。プロセス全体を通してチューブラベルを頻繁にチェックして、まだ読みやすいことを確認してください。ロジスティックス的に実現可能な場合は、この可能性に対するセーフガードとしてLaserJet印刷ラベルの使用を検討してください。上清がデカントされる方法は、試薬が微量遠心チューブの外側をドリブルダウンするかどうかに影響します。練習に伴う自信に満ちた滑らかな手で上清をデカントすることが重要です。デカンテーション中に遠沈管から花粉サンプルが失われないように注意する必要があります。デカントが速すぎると、花粉残渣の一部または全部を失う危険性があります。デカントが遅すぎると、上清がチューブを流れ落ちることがあります。100°Cのインキュベーション温度が一般的に推奨されますが、花粉は、特にわずかに長い期間インキュベートされた場合、この研究で使用された量(0.25g)では、その温度で容易に「過熱」になる可能性があります²⁹。実際、80°Cでも、アセト分解混合物中に長時間放置すると、花粉粒が破裂したり、損傷したりする可能性があります。インキュベーション温度と持続時間は、サンプル中の花粉粒を破壊しないように慎重に決定する必要があります。

花粉を染色すると、exineの特徴の定義とコントラストが向上し、写真撮影と識別が容易になります(図7)。1%サフラニンOの5滴(プラスチック転写ピペットから)は、0.25gの花粉を効果的に染色した。しかし、異なる花粉は異なる方法で染色する。花粉粒の汚れが軽すぎたり重すぎたりすると、識別が難しくなることがあります。可能であれば、研究で見つかると予想される花粉種を適切に染色するために必要な染色液の量は、実験サンプルの処理を開始する前に検証する必要があります。それにもかかわらず、実験サンプルの1つが適切に染色されていない場合、それは修正することができる。あまりにも重く染まった花粉サンプルを軽くするには、サンプルを水ですすぎ、次にエタノールですすいでください。花粉が目立つ特徴を見るのに十分なほどよく染色されていない場合は、さらに数滴の汚れを追加することができます。これらのサンプルの汚れは、グリセリンを添加する前にチェックする必要があります。同様に、花粉残渣のグリセリンの理想的な量を決定するために、いくつかの試行錯誤が必要な場合があります。15滴のグリセリンは、この研究のサンプルを乾燥から適切に保護し、花粉残渣を光学顕微鏡による下流同定に理想的な濃度に希釈した。他の量の花粉残渣は、乾燥を防ぎ、取り付けを容易にするために多かれ少なかれグリセリンを必要とするかもしれない。

著者らには開示するものは何もありません。

グレッチェン・ジョーンズ博士(USDA-ARS, APMRU, College Station, TX)がカラーソーティングとアセトリシス分析を支援してくれたことに感謝します。この研究は、オレゴン州養蜂家協会からR.R.S.に提供された研究資金によって支援されました。