Stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren

Binnenoorhaarcellen detecteren door geluid geïnduceerde verplaatsingen en transduceren deze stimuli in elektrische signalen in een haarbundel die bestaat uit stereocilia die zijn gerangschikt in rijen van toenemende hoogte. Wanneer stereocilia worden afgebogen, trekken ze aan kleine (~ 5 nm in diameter) extracellulaire tiplinks die stereocilia met elkaar verbinden, die krachten overbrengen naar de mechanosensitieve transductiekanalen. Hoewel mechanotransductie al tientallen jaren wordt bestudeerd in levende haarcellen, kunnen de functioneel belangrijke ultrastructurele details van de mechanotransductiemachinerie aan de uiteinden van stereocilia (zoals tiplinkdynamica of transductie-afhankelijke stereocilia remodeling) nog steeds alleen worden bestudeerd in dode cellen met elektronenmicroscopie. Theoretisch hebben scanning probe technieken, zoals atoomkrachtmicroscopie, voldoende resolutie om het oppervlak van stereocilia te visualiseren. Echter, onafhankelijk van de beeldvormingsmodus, beschadigt zelfs het geringste contact van de atoomkrachtmicroscopiesonde met de stereociliabundel meestal de bundel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de hoppping probe ion conductance microscopy (HPICM) beeldvorming van levende knaagdier auditieve haarcellen. Deze contactloze scanning probe-techniek maakt time-lapse beeldvorming van het oppervlak van levende cellen mogelijk met een complexe topografie, zoals haarcellen, met een resolutie van enkele nanometers en zonder fysiek contact met het monster te maken. De HPICM maakt gebruik van een elektrische stroom die door de glazen nanopipette gaat om het celoppervlak in de nabijheid van de pipet te detecteren, terwijl een piëzo-elektrisch systeem met 3D-positionering het oppervlak scant en zijn beeld genereert. Met HPICM waren we in staat om stereociliabundels en de verbindingen die stereocilia met elkaar verbinden in live auditieve haarcellen gedurende enkele uren in beeld te brengen zonder merkbare schade. We verwachten dat het gebruik van HPICM directe verkenning van ultrastructurele veranderingen in de stereocilia van levende haarcellen mogelijk zal maken voor een beter begrip van hun functie.